1700nm波段多光子成像技术的研究背景及其应用
多光子成像在生物医学特别是脑科学研究中应用广泛，为深层生物组织结构及动力学研究提供了非侵入性和非破坏性的成像手段。生物组织的吸收和强散射特性限制了成像深度。近年来，得益于原理及技术上的进步，多光子成像在活体生物中的成像深度显著提高。其中，1700nm波段激发的多光子成像显著降低组织吸收及散射，与其他激发波段相比获得了目前最大的成像深度。
多光子成像技术背景研究
技术的诞生与发展
自20世纪90年代康奈尔大学Denk等首次成功演示双光子激光扫描显微成像技术，多光子成像技术便在生命科学领域崭露头角。这项技术以其深层穿透（毫米量级）、非侵入式且无损、高空间分辨率（亚微米量级）以及强大的功能成像和动力学追踪能力，迅速在众多生命科学研究领域得到广泛应用。从复杂神经网络的描绘，到疾病的精准诊断；从神经细胞功能的深入探究，到血流变化的精确测量，多光子成像技术为科研工作者提供了前所未有的研究视角。
随着研究的不断深入，科研人员对多光子成像技术提出了更高的期望。在追求更高分辨率、更大视场、更快成像速度以及更深成像深度的道路上，多光子成像技术不断演进，逐渐形成了超分辨成像、大视场成像、高速成像和深层成像等多个发展方向。这些发展方向相互交织，共同推动着多光子成像技术向更高水平迈进。
深层成像面临的挑战
在多光子成像技术的发展历程中，深层成像一直是备受关注的重点领域。然而，生物组织的复杂特性却为深层成像带来了巨大的挑战。生物组织的结构极不均匀，这使得激发光在其中传播时会发生强烈的散射。同时，生物组织对激发光的吸收现象也较为显著，对于绝大多数组织而言，主要是水吸收。这两种因素叠加在一起，导致激发光功率随着成像深度的增加而呈指数衰减。
以活体动物脑成像为例，常用的钛宝石激光器在775nm波长激发时，活体小鼠脑血管的双光子荧光成像深度仅能达到脑表面下650μm，这一深度在解剖学上仅对应于灰质层。若要深入研究脑部的白质层和海马体等更深层结构，传统的成像技术就显得力不从心。为了突破这一限制，科研人员尝试了插入光学探针、使用显微内窥镜或者移除大脑灰质层等方法，但这些方法都违背了多光子成像无损、非侵入的优点。
突破挑战的策略第一种策略：是在低水吸收窗口采用更长的激发波长。研究发现，随着激发波长增加，成像深度不断增加。长波长激发能够有效降低生物组织的散射，同时在水吸收较低的情况下，确保更多激发光子能够到达样品焦点，从而在深层产生更强的多光子信号。
第二种策略：是采用更高阶非线性激发，如三光子成像。这种成像方式能够进一步抑制表面背景信号，显著提高深层的信号背景比。利用1665nm激发三光子荧光，科研人员实现了脑表面下2100μm的深层脑血管成像，这也是目前最深的多光子脑成像。而且，深层信号背景比达到46，显示出三光子成像在深层成像方面的巨大潜力。
在众多长波长激发波段中，1700nm波段凭借其独特的优势脱颖而出，成为了科研人员关注的焦点。它在降低组织吸收和散射方面表现优异，具有较大的有效衰减长度，理论上能够实现比其他波段更深的成像深度，为深层生物组织成像带来了新的希望。
1700nm波段多光子成像的原理剖析
多光子显微成像的神奇原理
1700nm波段多光子成像技术的基础是多光子显微成像原理，这一原理基于非线性光学效应，展现出令人惊叹的微观成像能力。单光子荧光和多光子荧光在产生机制上有着显著的区别。单光子荧光在整个激发光通路上都会产生；而多光子荧光则多个激发光子与物质相互作用，这种非线性的相互作用使得只有在焦点处才会产生显著的荧光信号。
这种特性赋予了多光子显微成像独特的优势。它不仅具有本征的三维成像能力，能够在三维空间中精准定位目标，还具备亚微米量级的高分辨率，能够清晰分辨微观结构，以及毫米量级的成像深度，可深入生物组织内部进行观测。多光子显微成像利用近红外波段激发，巧妙地减少了组织散射的影响，大大降低了激发光在传输过程中的损耗，使其能够实现深层生物组织成像。
多光子成像的模态分类多光子成像模态丰富多样，根据非线性激发阶次的不同，主要包括双光子、三光子以及更高阶次显微成像。双光子显微成像包含双光子荧光成像和二次谐波（SHG）成像，三光子显微成像则包括三光子荧光成像和三次谐波成像（THG）。
1700nm波段多光子成像的应用场景
活体小鼠深层脑血管成像
脑血管成像在深层脑成像中占据着重要地位，大脑中的血管为神经细胞和胶质细胞提供营养物质，同时清除代谢产物，对维持大脑正常功能起着关键作用。2013年，康奈尔大学Xu团队利用棒状光纤孤子自频移获得的1675nm孤子光源，首次实现了活体小鼠白质层的三次谐波成像（无标记）和海马体三光子荧光血管成像，成像深度达到1340μm，开启了1700nm波段多光子成像在脑血管成像领域的探索之旅。此后，科研人员不断优化飞秒脉冲孤子光源，提升成像深度和效果，实现了活体小鼠脑表面下2100μm的深层血管成像，这也是目前1700nm波段激发活体动物三光子荧光成像的最大成像深度，相比最初的成像深度有了显著提升。
1700nm波段激发不仅在三光子成像中表现出色，在双光子成像方面也有出色表现。此外，科研人员还发现1700nm波段双光子荧光血管成像已接近理论极限，而三光子荧光血管成像仍有很大的发展空间。
活体小鼠深层血流速度测量脑部的血液循环对于维持神经细胞的正常活动至关重要，血流速度成为反映神经细胞活动和某些脑部疾病的关键指标。多光子显微成像技术凭借其毫米量级成像深度和亚微米量级分辨率的优势，在血流动力学测量中得到广泛应用。科研人员通过将荧光染料注射到动物体内，确定待测血管后进行重复线扫成像，产生明暗交替条纹，然后通过计算条纹斜率来测量血流速度。考虑到荧光标记物注射可能对活体生物造成一定影响，科研人员致力于开发无标记多光子成像血流速度测量技术。
活体小鼠深层脑细胞成像
2013年，Horton等人借助1700nm波段三光子荧光成像技术，首次在非侵入条件下实现了转基因小鼠海马体神经细胞成像，成像深度达1076μm。这一成果为后续研究开辟了新方向。Cheng等人利用1700nm波段三光子作用截面测量系统，对比多种荧光标记物的三光子作用截面，确定了最优激发波长和最大作用截面。他们运用脑部微针注射技术标记小鼠脑部微胶质细胞，结合1700nm波段三光子荧光成像，实现了活体小鼠灰质层和白质层的微胶质细胞成像，成像深度为1124μm，是微胶质细胞双光子荧光成像深度的3.7倍，为深入研究脑部细胞结构和功能提供了清晰的视角。
活体小鼠头骨及穿透头骨成像
在自然生理环境下对活体小鼠进行脑成像研究，对神经网络和血管成像的发展至关重要。然而，颅窗植入、开颅和头骨打磨等手术会对小鼠脑部造成一定生理影响。例如，开颅手术可能改变颅内压，影响血管旁流体流动；手术机械压力会激活小鼠皮层的小胶质细胞和星形胶质细胞。因此，1700nm波段三光子成像技术成为穿透头骨成像的重要手段。
活体小鼠深层皮肤成像
多光子显微成像技术不仅在脑科学研究中成果丰硕，在皮肤科学研究领域也发挥着重要作用。可视化活体皮肤组织结构对皮肤疾病诊断、皮肤衰老检测意义重大。皮肤由表皮层、真皮层和皮下脂肪层构成，1700nm波段激发三光子显微成像已实现对活体小鼠完整皮肤的无标记成像。
髓鞘是周围神经系统的关键组成部分，手指皮肤结构异常与神经病变密切相关。He等人利用1700nm波段三光子荧光成像，结合特异性荧光染料标记手指皮肤髓鞘，实现了皮肤表面下340μm髓鞘成像。此外，由于外源性荧光标记物存在毒性和光漂白问题，无标记三次谐波成像在皮肤成像中愈发重要。髓鞘富含脂质结构，能产生强三次谐波信号，利用1700nm波段三光子成像研究小鼠趾部皮肤髓鞘结构，发现无标记三次谐波成像与三光子荧光成像共定位，可实现皮肤深层髓鞘成像，且具有无标记和不受光漂白影响的优势。
总结与展望
尽管1700nm波段多光子成像技术已取得显著进展，但仍面临诸多挑战。目前，该波段激发三光子荧光成像的成像深度受激发光源和荧光标记物的限制，仅能达到2100μm。在脑细胞成像和脑细胞动力学研究方面，该技术也存在局限性。结合自适应光学技术，通过矫正生物组织导致的光波波前畸变，有望进一步提升活体生物成像深度和分辨率。开发近红外波段的高亮度荧光探针也是关键方向之一。近红外荧光探针具有光损伤小、深层组织穿透能力强、对生物样品中生物分子背景自发荧光干扰小等优点，有利于实现更深层的组织成像。
声明：本文仅用作学术目的。
仝申, 钟金成, 陈新林, 邱娉, 王科. 1700nm波段超快光纤光源开发及其在多光子成像中的应用[J]. 激光与光电子学进展, 2024, 61(12): 1200001.
DOI：10.3788/LOP232274
