整体组织透明成像解析肿瘤微环境新机制

肿瘤微环境作为癌症发展进程中的关键角色，其内部的复杂机制一直是科研人员聚焦的重点。一项发表于《Communications Biology》的研究成果，借助组织透明化技术，为我们开启了深入了解肿瘤微环境的全新窗口，这一突破在癌症研究领域掀起了新的波澜。

研究背景与技术挑战
肿瘤微环境由癌细胞、各种非转化的基质细胞（如成纤维细胞、内皮细胞、免疫细胞等）以及细胞外基质组成。在肿瘤的发生、发展过程中，癌细胞与肿瘤微环境之间存在着复杂的相互作用。癌细胞可诱导肿瘤微环境发生改变，促进肿瘤血管生成、免疫逃逸等，而肿瘤微环境又为癌细胞提供营养物质、生长信号，帮助癌细胞侵袭和转移。

传统研究肿瘤微环境的方法存在诸多局限性。在体内研究方面，由于组织的不透明性，很难对肿瘤微环境进行整体、动态的观察。现有的成像技术，如磁共振成像（MRI）、计算机断层扫描（CT）等，虽然能提供宏观的解剖学信息，但分辨率不足以观察细胞和分子水平的变化，而显微镜技术虽然分辨率高，但观察深度有限，难以对深层组织进行成像。因此，开发一种能够突破这些限制的技术，对于深入理解肿瘤微环境的机制、推动癌症治疗的发展至关重要。

技术创新与应用
该研究团队对组织透明化技术进行了创新和优化。组织透明化技术旨在使不透明的组织变得透明，从而实现对组织内部结构的三维成像。研究人员通过大量的化学筛选，开发出了一套新的组织透明化方案，使用了三种组织透明化试剂：CUBIC-P−、CUBIC-L和CUBIC-R+。

CUBIC-P−主要用于组织的脱色，它能有效去除组织中的色素，减少光吸收，使组织更易于透明化处理。CUBIC-L具有脱色和脱脂的双重功能，它可以去除组织中的脂质成分，进一步提高组织的透明度。CUBIC-R+则用于调节组织的折射率，使组织的光学性质更均匀，减少光散射，从而提高成像质量。这三种试剂协同作用，能够在一天内实现小鼠多个器官（如肺、胰腺、脾脏等）的透明化，大大缩短了实验周期。与以往的组织透明化方法相比，新方案不仅效率更高，而且对组织的损伤更小，能够更好地保持组织的原有结构和生物学特性。

为了实现对肿瘤微环境的全面分析，研究人员将组织透明化技术与三维成像技术相结合。他们使用定制的光片荧光显微镜对透明化的组织进行成像，能够在不损伤组织的情况下，对整个器官进行高分辨率的三维成像。为了覆盖整个器官，显微镜的载物台可以在横向和轴向移动，同时检测物镜也会同步移动，以避免失焦。不同波长的激光可以激发不同的荧光标记，从而实现对多种细胞成分的同时成像。通过这种方式，研究人员能够获取肿瘤微环境中各种细胞和分子的三维空间信息。

为了更准确地分析三维成像数据，研究人员引入了机器学习技术。基于机器学习的方法，如使用ilastik软件进行像素分类，能够更准确地识别不同的细胞成分。研究人员首先对图像中的像素进行手动标注，将其分为真实信号、Z轴信号泄漏、强自发荧光和背景荧光等不同类别。然后，ilastik软件根据这些标注的像素特征，计算每个像素属于不同类别的概率。通过这种方式，能够更准确地对肿瘤微环境中的多种细胞成分进行分割和分析，避免了传统方法中因阈值设定不当而导致的误差。

成像实验与结果分析
利用优化后的组织透明化和成像技术，对小鼠实验性肺转移模型进行了深入研究。将人肺腺癌细胞通过静脉注射的方式接种到裸鼠体内，建立了肺转移模型。在不同时间点，对小鼠的肺部进行组织透明化处理和免疫染色，使用针对不同细胞成分的抗体。

通过三维成像，清晰地观察到了肿瘤微环境中各种细胞成分的空间分布。发现癌细胞在肺部形成了转移性定植，并且与肿瘤微环境中的多种细胞紧密相邻。通过测量癌细胞与不同细胞成分之间的距离，研究人员发现33%的癌细胞距离α-SMA阳性血管在10μm以内，24%的癌细胞距离VEGFR3阳性血管在10μm以内。这表明癌细胞与血管系统之间存在着密切的联系，血管可能为癌细胞提供了营养和转移的途径。还观察到肿瘤微环境中的巨噬细胞和血小板也与癌细胞存在着相互作用，这些细胞的分布与癌细胞的转移定植可能密切相关。

转化生长因子-β（TGF-β）是一种多功能细胞因子，在肿瘤的发展过程中具有复杂的作用。通过实验探究了TGF-β对癌细胞转移定植的影响，将TGF-β刺激和未刺激的癌细胞按照不同比例混合后注射到小鼠体内。结果发现，当混合注射TGF-β刺激和未刺激的癌细胞时，未刺激癌细胞的转移性定植数量明显增加。当未刺激癌细胞与TGF-β刺激癌细胞混合注射时，GFP阳性（未刺激癌细胞标记）的菌落数量比单独注射未刺激癌细胞时更多。这表明TGF-β刺激的癌细胞能够促进未刺激癌细胞的转移定植。

为了探究TGF-β刺激的癌细胞促进未刺激癌细胞转移定植的机制，研究人员进行了RNA测序分析。结果显示，TGF-β刺激癌细胞后，与凝血和炎症相关的基因表达上调。进一步的研究发现，TGF-β刺激的癌细胞能够激活肿瘤微环境中的血小板和巨噬细胞。通过抗体标记和成像分析，研究人员观察到TGF-β刺激的癌细胞与血小板和巨噬细胞的共定位增加。在血小板实验中发现，TGF-β刺激的癌细胞周围血小板的聚集明显增多。在巨噬细胞实验中，通过细胞因子阵列分析发现，TGF-β刺激的癌细胞能够促使肺部产生多种炎症细胞因子和趋化因子，这些因子能够激活巨噬细胞并促进其向肿瘤微环境迁移。

深远意义与未来展望
研究借助创新的组织透明化技术，深入剖析了肿瘤微环境，为理解肿瘤发展机制提供关键依据。理论上，揭示了TGF-β重塑肿瘤微环境的机制，以及癌细胞与血小板、巨噬细胞的相互作用关系，加深了我们对肿瘤生物学的认知。实践中，研究成果为癌症治疗提供新靶点，针对TGF-β信号通路、血小板或巨噬细胞的干预，有望成为抑制肿瘤转移的新策略，比如开发TGF-β抑制剂，或调节血小板、巨噬细胞功能来阻止癌细胞转移定植。

在未来研究可将组织透明化技术与基因编辑、蛋白质组学、代谢组学等前沿技术深度融合。利用基因编辑修饰特定基因，探究其在肿瘤微环境中的功能，结合蛋白质组学和代谢组学，分析蛋白质与代谢物分布变化，多层面揭示肿瘤发展本质。

声明：本文仅用作学术目的。文章来源于：Kubota, S.I., Takahashi, K., Mano, T. et al. Whole-organ analysis of TGF-β-mediated remodelling of the tumour microenvironment by tissue clearing. Commun Biol 4, 294 (2021). https://doi.org/10.1038/s42003-021-01786-y.