NIR-II荧光/光声双比率探针实现体内过硫化氢定量可视化
本文要点：本文报道了一种独特的H2S2介导的二硫醚形成反应。基于这一反应，研究者构建了第一个NIR-II荧光（FL）和光声（PA）双比率探针（NIR-II-H2S2），用于在体内可视化定量H2S2。该探针对Na2S2物种显示出双比率NIR-II荧光（I840/I1000，107倍）和光声（PA800/PA900，6.5倍）响应，具有高特异性、优异的灵敏度（1.8 nM）、改善的水溶性和深层组织渗透性。更重要的是，使用NIR-II双比率FL/PA成像，成功证明该探针可用于准确量化脂多糖或二甲双胍药物诱导的肝损伤小鼠模型中波动的H2S2水平。总的来说，这项研究不仅为H2S2相关的病理研究提供了一种有前景的工具，还提供了一个独特的识别位点，可以推广到未来设计更有用的H2S2成像剂。
方案1. NIR-II FL/PA 双比率探针NIR-II-H2S2用于定量可视化H2S2基于新发现的 H2S2-介导的二硫醇形成反应。
如方案1所示，NIR-II FL/PA双比率探针NIR-II-H2S2包含用作信号传感器的NIR-II花青荧光团支架和用作H2S2识别位点的1,3-二氯部分。该探针通过自校准的双比率NIR-II FL/PA读数显示出高特异性和敏感性、水溶性和对H2S2的实质性深层组织渗透。这项研究代表了H2S2探针开发的重大进步，因为之前报道的H2Sn探针无法准确区分不同的H2Sn物种。此外，利用双比值NIR-II FL/PA成像，研究者成功证明该探针可以准确量化脂多糖（LPS）/二甲双胍（MET）诱导的肝毒性小鼠模型中H2S2水平的波动；H2S2的变化水平与胱硫醚γ-裂解酶（CSE）的变化水平一致。总的来说，这种NIR-II FL/PA双比值探针可以为复杂生物系统中与H2S2相关的病理研究提供强有力的工具，新发现的1,3-二氯识别位点可以推广用于下一代精确H2S2成像剂的设计。
随后，为了将探针应用于体内成像，使用UV/Vis吸收、荧光和PA光谱研究了NIR-II-H2S2对H2S2的双比率NIR-II FL/PA响应。NIR-II-H2S2在PBS/EtOH（7/3，v/v）中的UV/Vis吸收如图1a所示。随着H2S2（此处，Na2S2充当H2S2的供体）浓度的增加，以900 nm为中心的吸收峰减小，而在800 nm处出现了新的吸收信号。值得注意的是，图1d中观察到强烈的线性相关性，表明NIR-II-H2S2可以作为H2S2的比色探针。此外，测量了不同浓度H2S2的荧光滴定光谱，显示在1000 nm处的发射峰降低，在840 nm处出现了一个新的发射峰（图1b和1c）。约160nm的大发射偏移和良好分离的双发射带表明NIR-II-H2S2对H2S2具有优异的NIR-II荧光比率响应行为。荧光强度比（I840/I1000）提高了约107倍，并与H2S2浓度呈线性关系（图1e）。基于荧光比，使用NIR-II-H2S2计算出的H2S2检测限（3σ/k）约为1.8nM，可以在相对较低的浓度下有效检测H2S2。
NIR-II-H2S2可用于在复杂的生物系统中选择性地检测H2S2活性（图1g）。与吸收光谱中观察到的变化类似，NIR-II-H2S2探针的光声光谱在添加Na2S2后逐渐蓝移。比色传感行为表明，该探针可能实现H2S2的比率光声检测。此外，NIR-II-H2S2溶液的PA成像显示，用Na2S2滴定时，着Na2S2从0增加到80μM，PA800/PA900几乎线性地从约0.91±0.02增加到5.91±0.09。此外，PA强度比（PA800/PA900）增加了约6.5倍（图1f）。NIR-II比率荧光增强（I840/I1000）明显大于PA比率（PA800/PA90）增强，表明荧光成像的灵敏度可能优于PA成像。
此外，体外PA选择性实验表明，干扰物种没有引起PA800/PA900的显著变化（图1h），这与荧光选择性结果一致（图1g）。因此，NIR-II-H2S2在双比率NIR-II FL/PA检测中表现出优异的H2S2特异性。随后，对添加Na2S2后I840/I1000比值随时间的变化进行跟踪，结果表明NIR-II- H2S2与H2S2反应迅速，并在8分钟内达到饱和（图1i）。此外，还研究了pH值对NIR-II- H2S2与H2S2反应的影响。结果表明，NIR-II-H2S2适合通过NIR-II FL/PA双比值模式在体外捕获H2S2。
实现足够的信号穿透一直是体内荧光成像的一个挑战，特别是在研究体内深处的生物结构时。为了评估NIR-II- H2S2的组织穿透能力，使用含有NIR-II-H2SO4（NIR-II染料的代表）或Cy-Cl（NIR-I染料的代表）的毛细管进行了脂肪乳剂体模成像，该毛细管在指定的体模深度浸入1%的脂肪乳剂溶液中，作为组织的模拟（图2a）。如图2a所示，即使在7mm的浸没深度下，NIR-II-H2S2在NIR-II区域（>1000nm）的管边界也清晰可辨，而Cy-Cl在NIR-I区域的管边界则显得模糊且无法区分。NIR-II-H2S2（7mm）的穿透深度几乎是Cy-Cl（1mm）的七倍。此外，在模拟生物组织的5mm深度处，NIR-II-H2S2的信噪比（SBR）（约11.3）比Cy-Cl（约1.1）高出约十倍（图2b）。这些结果表明，NIR-II-H2S2具有更高的成像分辨率和对比度，适用于体内深组织成像应用。
为了评估NIR-II- H2S2在体外检测H2S2的潜力，研究者最初在离心管中进行了NIR-II FL/PA双比值成像实验（图2). 在没有Na2S2的情况下，NIR-II-H2S2的NIR-II荧光成像比值在0至30分钟内随时间变化最小，保持在约1.82±0.05的值（图2c和2d）。在图2e和2f中，添加Na2S2后，相应的荧光比随时间从1.81±0.03上升到6.92±0.06，大约增加了3.8倍。同样，图2g-2i显示，NIR-II-H2S2单独的PA信号比保持稳定在0.92±0.03左右；然而，随着Na2S2的引入，PA的比例增加了一倍多，上升到2.20。结果表明，添加Na2S2的试管中NIR-II FL/PA比值发生了显著变化，从而证实了NIR-II-H2S2在体外检测H2S2的有效性。
图3. 小鼠腹腔中NIR-II- H2S2 的NIR-II荧光-光声比率成像
随后，为了评估NIR-II-H2S2作为检测外源性H2S2的化学工具的体内检测能力，将探针和Na2S2注入小鼠腹腔（图3）。在30分钟内监测探针的NIR-II荧光和PA双比值信号的变化。成像结果表明，在注射探针和生理盐水后，NIR-II比率信号强度（I850/I1000）没有显示出明显的变化（图3a和3d）。相比之下，在注射探针和外源性Na2S2后（图3b），NIR-II FL信号强度在850 nm处随着时间的延长而增加，而在1000 nm处观察到减少，FL强度迅速增加，在20分钟内达到平稳。NIR-II比值信号强度（I850/I1000）从0.83±0.02增加到1.94±0.01，约为2.33倍。此外，比率PA成像显示了类似的趋势。作为比较，仅施用探针后，小鼠在两个通道（PA800和PA900）上的PA强度没有显著变化。然而，如图3e所示，在与Na2S2相互作用后，PA比值信号（PA800/PA900）从0.90±0.02增加到1.51±0.03，大约增强了1.70倍。三维多光谱光声断层扫描（3D MSOT）图像进一步证实，外源性H2S2在小鼠腹腔内的相对位置可以在体内特异性和直接观察到（图3g和3h）。这些实验结果进一步证实了NIR-II-H2S2可以通过NIR-II-FL/PA双比值成像在体内有效地显示外源性H2S2的发现。
图4. 肝损伤中NIR-II-H2S2 的NIR-II荧光-光声比率成像
选择BALB/c裸鼠建立小动物模型，用于鉴定肝损伤期间的H2S2水平。图4中描绘的小鼠分为五组。最初，三组LPS处理的小鼠腹腔注射不同剂量的LPS以诱导肝损伤（图4a） 注射生理盐水和炔丙基甘氨酸（PAG，一种CSE抑制剂）的小鼠分别作为对照组和抑制组。随后，通过尾静脉给药NIR-II-H2S2进行体内NIR-II-FL比率成像。与对照组相比，LPS治疗组的850 nm LP图像在0至30分钟内肝脏区域显示出显著的NIR-II荧光增强，而1000 nm LP图像显示出逐渐减弱。此外，相应的NIR-II FL比率测量信号（I850/I1000）在20分钟（探针富集15分钟后开始的时间）达到最大值。20分钟时获得的定量数据显示，随着LPS剂量的增加，肝脏中的I850/I1000比值增加了约2倍，从0.88±0.03增加到1.76±0.02（图4b、4d-f），表明肝损伤中H2S2水平很高。在PAG抑制组中，观察到850 nm LP信号的强度降低，NIR-II FL比率信号（I850/I1000）降低到对照组中观察到的水平（图4d和4f）。
接下来，在LPS诱导的肝损伤后，使用多光谱光声断层扫描（MSOT）系统对LPS诱导的内源性H2S2上调的NIR-II-H2S2进行实时比率PA成像。PA成像的实验条件和模型与NIR-II比率FL实验相同。对20分钟内采集的成像数据进行进一步分析（图4c，4 g–i）显示PA800/PA900比值从0.93±0.03急剧增加到1.96±0.08，约为2.11倍。同时还观察到，在抑制组中，PA比值信号降至对照组的水平。腹腔注射LPS 12小时后，小鼠血清中丙氨酸转氨酶（ALT）和天冬氨酸转氨酶（AST）的水平逐渐升高（图4j和4l）。不同剂量LPS治疗前后肝组织切片的H&E染色也显示，随着LPS剂量的增加，肝损伤程度相应增加（图4k）。通过血清生物标志物检测和组织学分析获得的结果与体内NIR-II FL/PA双比值成像结果一致。这些发现表明，NIR-II-H2S2适用于实时NIR-II FL/PA双比值成像，以检测LPS诱导的肝损伤过程中产生的H2S2，并有望成为研究H2S2相关病理和治疗机制的有效工具。
图5. MET诱导的小鼠肝损伤模型和成像实验
为了进一步评估NIR-II-H2S2在内源性H2S2体内NIR-II FL/PA双比值成像中的潜力，建立了MET诱导的肝毒性模型，并将小鼠随机分为五组（图5a）。正如预期的那样，静脉注射NIR-II-H2S2后，实时NIR-II FL成像显示，MET治疗组在小鼠肝脏区域的850 nm通道附近显示出强烈的NIR-II荧光信号，在1000 nm通道处显示出相对较弱的信号（图5b）。相比之下，在抑制组中，与MET处理组相比，观察到850nm通道减少，1000nm通道增加。有趣的是，NIR-II FL比率图像表明，随着MET浓度的升高，比率FL信号（I850/I1000）显著增加，从0.81±0.04增加到1.73±0.06（图5c），这意味着MET诱导的H2S2生成的检测非常可靠。同时，比率PA成像进一步显示，PA比率（PA800/PA900）从正常小鼠肝脏中的1.00±0.02增加到MET治疗组肝脏中的2.21±0.05（图5d和5h），约为2.21倍。与正常组相比，MET治疗的小鼠血清中ALT和AST水平逐渐升高（图5g和5i），证实了MET过量引起的不同程度的肝毒性。同时，不同剂量MET治疗前后肝组织的H&E染色也表明，随着MET剂量的增加，肝损伤程度相应增加（图5e）。至关重要的是，通过血清生物标志物检测或组织学分析获得的结果与FL/PA成像结果和CSE蛋白质印迹分析结果一致（图5f）。本研究首次应用NIR-II FL/PA双比值成像探针阐明H2S2与LPS/MET诱导的肝毒性之间的关系，从而为H2S2水平的体内定量可视化和探索H2S2在炎症性疾病中的相关作用提供了有利的分子工具。
总之，基于新发现的H2S2介导的二硫醚形成反应，本文首次成功构建了NIR-II FL/PA双比值探针NIR-II-H2S2，用于体内内源性H2S2的定量检测和可视化。这种独特的反应对Na2S2显示出极高的选择性，而其他生物RSS（包括GSH、Cys、Hcy、Na2S、Na2S4和S8）则没有发生这种反应。研究者们设计的探针NIR-II-H2S2由一个用作信号报告单元的NIR-II荧光团支架和一个用作识别位点的新型1,3-二氯部分组成。体外和体内实验表明，探针NIR-II-H2S2能够对Na2S2物种产生双比率NIR-II FL（I840/I1000，107倍）和PA（PA800/PA900，6.5倍）反应，具有高特异性、优异的灵敏度、改善的水溶性和深层组织渗透性。这一进展也标志着H2S2探针开发的实质性改进，因为之前报道的H2Sn探针无法准确区分深部组织中的不同H2Sn物种。此外，凭借NIR-II FL/PA双比值成像的互补优势，研究者成功地证明了该探针可以精确量化肝损伤小鼠深部肝组织中H2S2水平的波动。目前，这是首次使用NIR-II FL/PA双比值探针NIR-II-H2S2阐明H2S2与LPS/MET诱导的肝毒性之间的关系。因此，本研究为理解H2S2在生命系统中的生物学功能提供了一种实用且有前景的工具。新发现的1,3-二氯识别位点可以促进用于各种生物应用的下一代H2S2成像剂的设计。
参考文献
Hu B, Liu Q, Jiang Y, et al. NIR‐II Fluorescence/Photoacoustic Dual Ratiometric Probes with Unique Recognition Site for Quantitatively Visualizing H2S2 in Vivo[J]. Angewandte Chemie, 2024: e202418378.
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