iPEGASOS组织透明在小鼠脑成像研究的应用

在神经科学研究领域，大脑就像一座神秘的城堡，吸引着无数科学家去探索其中的奥秘。然而，长期以来，由于技术的限制，想要清晰地观察大脑内部的结构和细胞活动，就如同隔着一层迷雾。直到组织透明化技术和相关成像方法的出现，才让这层迷雾逐渐散去，而iPEGASOS技术更是其中的佼佼者。今天，就让我们一起走进这一技术的奇妙世界，看看它是如何为大脑成像带来革命性变化的。
 

研究背景
传统大脑研究方法的困境
随着研究的不断深入，科研人员对多光子成像技术提出了更高的期望。在追求更高分辨率、更大视场、更快成像速度以及更深成像深度的道路上，多光子成像技术不断演进，逐渐形成了超分辨成像、大视场成像、高速成像和深层成像等多个发展方向。这些发展方向相互交织，共同推动着多光子成像技术向更高水平迈进。

经典的组织学方法，也就是依靠大脑切片来研究大脑结构，一直是解剖神经科学研究的基础，这种方法存在着诸多问题。一方面，由于组织不透明，光线很难穿透到大脑深层样本中，为了克服这个问题，科学家们尝试将二维的大脑切片进行数字化重建，试图构建出三维的大脑视图，但可能出现误差，而且在切片过程中还会对组织造成物理损伤，会影响高分辨率重建的准确性。另一方面，整个切片、安装、处理和扫描的过程非常繁琐，不仅耗费大量的人力和时间，还易出错。

组织透明化技术的兴起
其实，组织透明化的尝试早在一个世纪前就已经开始了，但真正得到广泛关注和发展，还是得益于成像技术的进步，比如光片显微镜的出现，能对整个小鼠大脑这样的大样本进行单细胞分辨率的光学扫描。可以通过调整激光束和检测平面的位置，获取不同深度的光学切片，最后将这些切片组合起来，形成整个组织的三维重建图像，让我们能够详细地观察到样本内部结构的空间组织。

随着研究的深入，各种各样的组织透明化方案不断涌现。这些方案虽然使用的化学物质不同，但基本原理是相似的，都包括组织固定、脱钙（如果样本包含骨头）、脱色（去除内源性色素）、脱脂（去除脂质）以及折射率匹配（让样本和成像介质的折射率一致，以达到最大透明度）等步骤。

iPEGASOS技术的诞生
尽管组织透明化技术取得了很大进展，但目前大多数透明化方案在与免疫标记技术结合时还存在问题。荧光报告基因常被用于可视化感兴趣的分子，然而在透明化过程中，基于基因靶向方法的荧光信号强度通常会降低。有时候，即使使用转基因和病毒辅助基因递送，荧光信号在透明化后也可能变得非常微弱，甚至无法与背景噪声区分开来。而且，抗体很难穿透到整个大脑这样的大组织的深层，限制了全脑标记。

为了解决这些问题，从两种成熟的方案——iDISCO染色和PEGASOS透明化中汲取灵感，开发出了iPEGASOS技术。不仅能让组织具有出色的透明度，还能在长达一年的时间里保持强大的荧光信号，并且能够让抗体深入穿透大型组织，包括整个小鼠大脑。

iPEGASOS技术的实验过程
实验动物准备
在实验中，研究人员使用了多种成年小鼠。这些小鼠就像是不同的“研究模型”，每一种都有其独特的特点，为研究提供了多样化的视角。

iPEGASOS溶液制备：
脱色溶液用于去除样本中的色素；脱脂溶液能有效去除脂质；染色预处理溶液、通透溶液、封闭溶液、染色溶液等则在免疫染色过程中发挥着关键作用，帮助抗体更好地与目标结合；脱水溶液和透明介质则用于脱水和提高样本透明度，让大脑样本变得更加“清澈”。

iPEGASOS被动浸泡程序：
固定后的脑组织要先清洗，然后依次浸泡在脱色溶液、脱脂溶液、通透溶液、封闭溶液、染色溶液中进行免疫染色，之后还要进行第二轮脱脂、脱水和透明化处理，最后才能进行成像。而且，不同大小的样本在各个步骤中的孵育时间也有所不同，都需要精确控制。

从大脑的背侧到腹侧，在不同深度的光学切片中都能观察到丰富而强烈的信号，即使在光学像差最严重的腹侧部分，也能实现单细胞分辨率成像。通过对这些信号的分析和三维重建，我们能够清晰地看到VIP神经元细胞体及其相关过程，包括树突的结构。

实现完整小鼠大脑的神经回路映射
为了深入了解大脑的神经回路，研究人员使用病毒示踪剂来标记神经回路。iPEGASOS技术在为注射了病毒示踪剂的大脑提供了出色的信噪比，让神经元和神经过程都能清晰成像。在这个过程中，不仅能够观察到起始细胞和单突触输入细胞的位置，还能清晰地看到轴突束和单个轴突的形态，甚至能够追踪单个轴突丘脑路径，这对于理解神经回路的连接和功能具有重要意义。

追踪阿尔茨海默病小鼠模型中β-淀粉样蛋白的积累
研究人员使用iPEGASOS技术对小鼠模型进行研究，这是一种快速发展出明显淀粉样病理的小鼠模型。通过对不同年龄的小鼠大脑进行免疫染色，使用抗体来检测β-淀粉样蛋白的沉积，该技术能够清晰地捕捉到β-淀粉样蛋白斑块在大脑中的分布和随年龄的变化。从6个月大开始，β-淀粉样蛋白斑块就已经出现在整个皮层，随着年龄的增长，斑块逐渐积累并扩散到其他脑区。而且，通过对信号强度和斑块面积的量化分析，进一步证实了该技术在追踪β-淀粉样蛋白积累方面的有效性，为研究阿尔茨海默病的发病机制和治疗提供了重要的工具。

iPEGASOS技术的优势突破
保留荧光信号能力强
在小鼠脑切片实验中，iPEGASOS处理的样本不仅保留了可见的内源性GFP信号，免疫染色信号强度也更高。这表明iPEGASOS能更好地利用样本已有的荧光信号，同时增强免疫染色效果。

成本效益和抗体兼容性好
与其他免疫染色策略相比，iPEGASOS采用增强样本通透性的方法，使用常见且廉价的试剂，与标准的两步间接荧光免疫染色过程兼容。这使其在成本效益和抗体兼容性方面优势明显，且无需特殊实验设备，降低了实验门槛。

成像及样本保存优势突出
与基于2D切片的3D重建技术相比，iPEGASOS结合光片显微镜成像，具有成像时间短、可多次成像、样本保存时间长等优点。虽然PEGASOS存在组织收缩问题，但iPEGASOS在一定程度上进行了改善，并且能够对厚组织进行免疫染色，这是许多2D切片技术无法实现的。

实验总结与展望
尽管iPEGASOS技术已经取得了很大的成功，但仍然有一些问题需要进一步研究。比如，在成像配置方面，虽然研究人员通过实验证明了成像视角对信号强度的影响不大，但对于一些需要精确比较全脑区域信号强度的研究，还需要探索更好的成像策略，以减少潜在的偏差。此外，随着神经科学研究的不断深入，对于大脑结构和功能的研究要求也越来越高。未来，iPEGASOS技术可能会与其他先进技术相结合，进一步提高成像分辨率和对复杂神经回路的解析能力。同时，在研究神经退行性疾病等方面，iPEGASOS技术也有望为药物研发和治疗方案的制定提供更有力的支持。通过这项技术，我们能够更清晰地观察大脑的结构和功能，深入了解神经回路的奥秘，为神经科学研究和相关疾病的治疗带来了新的希望。

论文信息
声明：本文仅用作学术目的。
Gao P, Rivera M, Lin X, Holmes TC, Zhao H, Xu X. Immunolabeling-compatible PEGASOS tissue clearing for high-resolution whole mouse brain imaging. Front Neural Circuits. 2024 Apr 17;18:1345692.
DOI: 10.3389/fncir.2024.1345692.