动物活体成像之生物发光实验技巧及注意事项
通过上期的介绍，我们已经知道，生物发光和荧光作为最常见两种光学成像技术，各有特点。其中生物发光技术因其背景噪音低，灵敏度高等优点，在肿瘤，分子互作及信号传导等研究中得到了广泛应用。当两种方法都适用于研究对象时，更推荐用生物发光标记方法开展成像实验。
一个完整的生物发光实验流程，至少应包括实验设计（选择合适的荧光素酶报告基因和荧光素底物）、细胞培养与转染（将荧光素酶报告基因转染至细胞中，使其表达荧光素酶）、动物模型准备（选择适当的动物模型，并根据需要进行基因编辑或诱导特定病理状态）、细胞注射或移植（将标记细胞注射或移植到动物模型中）、荧光素底物注射（在成像前向动物注射底物，可通过腹腔注射、静脉注射或口服等方式）、成像观察（使用高灵敏度的活体成像系统，在预定的时间点捕捉生物发光信号）等。
本期，我们将深入探讨生物发光活体成像系统的实验技巧，从荧光素的选择到实验结果的分析，逐一探讨生物发光实验的注意事项及技巧。
荧光素的选择
荧光素酶与荧光素的化学反应是生物发光的基础，选择合适的发光酶和底物是实验成功的第一步。生物发光活体成像系统常用的发光酶包括萤火虫萤光素酶、海肾萤光素酶等。实验一般选用萤火虫萤光素酶，有时也会用海肾萤光素酶。
二者区别如下表所示：
体外验证
将构建的细胞加入150μg/ml D-luciferin 底物溶液2分钟后使用IVScope小动物活体成像系统观测，然后进行生物发光的定量分析。
计算单个细胞单位时间发出的光子数，当数值大于100时，适合进行体内实验，数值过低或过高，都不适合体内成像或长期观测。将定量数据绘制标准曲线，计算标准差，线性好证明细胞表达稳定，线性差则表明荧光素酶表达不稳定，同样不适合进行体内实验。
细胞接种
确保细胞是在良好的生长状态下，并且已经稳定转染或转录了荧光素酶基因。在接种前，使用细胞计数器或自动细胞计数仪对细胞进行准确计数。接种部位和数量应根据实验需求进行调整，将细胞接种到实验动物体内。确保细胞在体内生长、扩散，以产生稳定的发光信号。
荧光素底物注射
将萤光素或其它底物注射入实验动物体内。实验总结出荧光素的合适的用量是150mg/kg，即体重20克的小鼠需要3毫克的荧光素。注射方式有静脉注射、腹腔注射、鼻吸（i.n.）或其他方式。
腹腔注射（i.p.）：腹腔注射扩散较慢，持续发光长。
静脉注射（i.v.）：血液运输，灵敏度高，重复性好。信号来的快，去的也快
鼻吸（i.n.）：适合于肺部成像
根据实验目的和动物模型的特点，选择合适的注射方式。注射时，需注意注射速度、剂量和浓度，以确保发光信号在体内均匀分布。
体内预实验确定最佳成像条件
在正式实验前，进行预实验以确定发光时间线和最佳拍摄时间。一般情况下，腹腔注射底物约一分钟后表达荧光素酶的细胞开始发光，十分钟后强度达到最高。在最高点持续约20-30分钟后开始衰落，约三小时后发光全部消失。所以最好的检测时间是在注射后15-35分钟内。
成像设备的选择
在生物发光实验中，合适的仪器对确保实验结果的准确性和可靠性至关重要。
理想的成像仪器应具备以下特点：
1. 高灵敏度
选择具有高灵敏度的仪器，以便检测低水平的信号，这对于早期疾病检测和微小变化的监测至关重要。
2. 高分辨率
考虑仪器的动态范围和分辨率，高分辨率仪器能够提供更清晰的图像，有助于更精确地定位和量化生物学过程。
3. 宽动态范围
仪器应具有宽广的动态范围，能够同时检测到从低到高的信号强度。以保证在不同条件下都能获得清晰的信号和高质量的图像。仪器的背景噪声应尽可能低，以提高信噪比。
4. 操作便利性、环境适应性及样本兼容性
选择用户界面友好、易于操作的设备，且能够适应不同的实验条件和样本类型。考虑仪器与其他实验设备的兼容性，以及未来升级或添加新功能的潜力。
5. 良好的技术支持和服务
确保在遇到操作或技术问题时能够得到及时有效的帮助。综合这些因素，选择适合的生物发光实验仪器，将有助于提高实验的成功率和数据的质量。
实验结果判读和分析
获取高质量的成像数据只是研究的一部分，结果的判读与数据分析同样重要。它能帮助研究人员从图像中提取有价值的信息，并得出科学结论。
1. 图像优化处理：采用软件对拍摄到的图像进行优化处理、灰度调节、伪彩色处理等，以提高图像质量。
2. 定义感兴趣区域（ROI）：计算发光强度、发光面积、发光信号变化等参数，分析实验结果。可使用统计学方法对数据进行处理，以得出有意义的结论。
3. 多图分析：不同时间点成像结果的分析要用到多图分析，数据归一化有助于消除偏差，批量ROI圈选及计算，生成动力学曲线、批量导出图片及动态展示等提高了结果的可读性和理解性。
结论
综上所述，生物发光活体成像在实验过程中涉及多个环节，掌握各个方面的技巧和方法对于获得可靠、准确的实验结果至关重要。
一个完整的生物发光实验流程，至少应包括实验设计（选择合适的荧光素酶报告基因和荧光素底物）、细胞培养与转染（将荧光素酶报告基因转染至细胞中，使其表达荧光素酶）、动物模型准备（选择适当的动物模型，并根据需要进行基因编辑或诱导特定病理状态）、细胞注射或移植（将标记细胞注射或移植到动物模型中）、荧光素底物注射（在成像前向动物注射底物，可通过腹腔注射、静脉注射或口服等方式）、成像观察（使用高灵敏度的活体成像系统，在预定的时间点捕捉生物发光信号）等。
本期，我们将深入探讨生物发光活体成像系统的实验技巧，从荧光素的选择到实验结果的分析，逐一探讨生物发光实验的注意事项及技巧。
荧光素的选择
荧光素酶与荧光素的化学反应是生物发光的基础，选择合适的发光酶和底物是实验成功的第一步。生物发光活体成像系统常用的发光酶包括萤火虫萤光素酶、海肾萤光素酶等。实验一般选用萤火虫萤光素酶，有时也会用海肾萤光素酶。
二者区别如下表所示：
体外验证
将构建的细胞加入150μg/ml D-luciferin 底物溶液2分钟后使用IVScope小动物活体成像系统观测，然后进行生物发光的定量分析。
计算单个细胞单位时间发出的光子数，当数值大于100时，适合进行体内实验，数值过低或过高，都不适合体内成像或长期观测。将定量数据绘制标准曲线，计算标准差，线性好证明细胞表达稳定，线性差则表明荧光素酶表达不稳定，同样不适合进行体内实验。
细胞接种
确保细胞是在良好的生长状态下，并且已经稳定转染或转录了荧光素酶基因。在接种前，使用细胞计数器或自动细胞计数仪对细胞进行准确计数。接种部位和数量应根据实验需求进行调整，将细胞接种到实验动物体内。确保细胞在体内生长、扩散，以产生稳定的发光信号。
荧光素底物注射
将萤光素或其它底物注射入实验动物体内。实验总结出荧光素的合适的用量是150mg/kg，即体重20克的小鼠需要3毫克的荧光素。注射方式有静脉注射、腹腔注射、鼻吸（i.n.）或其他方式。
腹腔注射（i.p.）：腹腔注射扩散较慢，持续发光长。
静脉注射（i.v.）：血液运输，灵敏度高，重复性好。信号来的快，去的也快
鼻吸（i.n.）：适合于肺部成像
根据实验目的和动物模型的特点，选择合适的注射方式。注射时，需注意注射速度、剂量和浓度，以确保发光信号在体内均匀分布。
体内预实验确定最佳成像条件
在正式实验前，进行预实验以确定发光时间线和最佳拍摄时间。一般情况下，腹腔注射底物约一分钟后表达荧光素酶的细胞开始发光，十分钟后强度达到最高。在最高点持续约20-30分钟后开始衰落，约三小时后发光全部消失。所以最好的检测时间是在注射后15-35分钟内。
麻醉方法
为减少实验动物在成像过程中的运动干扰，需对其进行麻醉。选择合适的麻醉药物和剂量，确保动物在成像过程中处于稳定状态，保证获得的实验数据准确可靠，又能最大限度地保障动物福利，确保其安全。实验动物一般较难合作，因此实验中常采用全身麻醉，根据麻醉方式分为吸入麻醉和非吸入麻醉。
为减少实验动物在成像过程中的运动干扰，需对其进行麻醉。选择合适的麻醉药物和剂量，确保动物在成像过程中处于稳定状态，保证获得的实验数据准确可靠，又能最大限度地保障动物福利，确保其安全。实验动物一般较难合作，因此实验中常采用全身麻醉，根据麻醉方式分为吸入麻醉和非吸入麻醉。
生物发光实验可以在底物注射后再进行麻醉。
吸入麻醉与注射麻醉的区别如下表：
在生物发光实验中，合适的仪器对确保实验结果的准确性和可靠性至关重要。
理想的成像仪器应具备以下特点：
1. 高灵敏度
选择具有高灵敏度的仪器，以便检测低水平的信号，这对于早期疾病检测和微小变化的监测至关重要。
2. 高分辨率
考虑仪器的动态范围和分辨率，高分辨率仪器能够提供更清晰的图像，有助于更精确地定位和量化生物学过程。
3. 宽动态范围
仪器应具有宽广的动态范围，能够同时检测到从低到高的信号强度。以保证在不同条件下都能获得清晰的信号和高质量的图像。仪器的背景噪声应尽可能低，以提高信噪比。
4. 操作便利性、环境适应性及样本兼容性
选择用户界面友好、易于操作的设备，且能够适应不同的实验条件和样本类型。考虑仪器与其他实验设备的兼容性，以及未来升级或添加新功能的潜力。
5. 良好的技术支持和服务
确保在遇到操作或技术问题时能够得到及时有效的帮助。综合这些因素，选择适合的生物发光实验仪器，将有助于提高实验的成功率和数据的质量。
实验结果判读和分析
获取高质量的成像数据只是研究的一部分，结果的判读与数据分析同样重要。它能帮助研究人员从图像中提取有价值的信息，并得出科学结论。
1. 图像优化处理：采用软件对拍摄到的图像进行优化处理、灰度调节、伪彩色处理等，以提高图像质量。
2. 定义感兴趣区域（ROI）：计算发光强度、发光面积、发光信号变化等参数，分析实验结果。可使用统计学方法对数据进行处理，以得出有意义的结论。
3. 多图分析：不同时间点成像结果的分析要用到多图分析，数据归一化有助于消除偏差，批量ROI圈选及计算，生成动力学曲线、批量导出图片及动态展示等提高了结果的可读性和理解性。
结论
