利用趋化蛋白寻找染料产生仿生NIR-II荧光蛋白用于多色深组织生物成像
本文要点：近红外 I/II 荧光蛋白 （NIR-I/II FPs） 对于体内成像至关重要，但目前的 NIR-I/II FP 面临着包括稀缺性、发色团成熟要求和发射波长有限（通常< 800 nm）等挑战。在这里，我们利用合成蛋白质寻求的 NIR-II 染料作为发色团，通过位点特异性亲核取代反应与标签蛋白（例如人血清白蛋白、HSA）共价结合，从而创建概念验证仿生 NIR-II FP。这种化学蛋白寻找策略可以在温和的生理条件下完成，无需催化。蛋白质组学分析可识别特异性结合位点（DIII上的Cys 477）。NIR-II FP显著增强了发色团的亮度和光稳定性，同时提高了生物相容性，从而实现了高性能的NIR-II淋巴造影和血管造影。该策略具有通用性，适用于创建各种光谱分离的NIR-I/II FP，用于实时可视化多个生物事件。总体而言，这种简单的仿生方法有可能改变基于荧光蛋白的生物成像，并使原位白蛋白靶向能够产生用于活生物体深层组织成像的NIR-I/II FP。
本文成功地设计并构建了一个仿生NIR-II荧光蛋白系统。该系统利用趋化蛋白质寻求染料（例如，NIR-II CO-1080和其他NIR-I/II染料）作为发色团，其通过亲核取代反应共价结合到蛋白质（例如，人血清白蛋白，HSA）的疏水腔中的半胱氨酸。本文的仿生NIR-II FPs能够通过简单的静脉注射对血管和淋巴系统的生理和病理状况进行无创、准确的NIR-II可视化，极大地促进了术中成像指导的手术和术后无创监测。利用独特的1064 nm最佳激发NIR-II荧光粉，结合808nm激发实现生物事件的多色成像的NIR-I FPs。这项工作为仿生NIR-I/II FPs提供了概念验证，有效地克服了NIR-FPs的现有局限性，并有可能实现NIR-II生物成像的真正优势。
从仿生学的角度，本文提出了一种用于构建 NIR-II FP 的化学选择性蛋白质搜索策略。CO-1080通过超分子相互作用进入蛋白质口袋，并通过蛋白质中的-SH基团和CO-1080中的Cl-C键之间的亲核取代反应进行共价结合（称为 “蛋白质寻找策略”）。在检查的三种蛋白质中，HSA@CO-1080 FPs表现出最佳的NIR-II发光能力，荧光增强高达22.13倍（图1b–d ）。
为了更好地了解不同蛋白质与NIR-II发色团的结合机制，进行了基于滑行程序的非共价分子对接模拟（图1e-g）。结果表明，HSA和CO-1080发色团的对接分数最好，结合能最高。HSA可以有效地限制CO-1080的自由扭曲，并最大限度地减少非辐射跃迁引起的能量耗散，从而现出最佳的NIR-II发光能力。
接下来，SDS-PAGE凝胶电泳表明，BSA@CO-1080和HSA@CO-1080 FP在相应的分子量下都显示出明亮的荧光带，验证了与CO-1080染料的相当和高效的共价结合（图1）。高分辨率质谱（HRMS）也证实了CO-1080与相应蛋白质之间的共价结合，同时突出了HSA与CO-1080之间的最佳共价结合效率。HSA蛋白是CO-1080标记/靶向的最佳候选蛋白，能够产生稳定明亮的NIR-II荧光蛋白。
HSA@CO-1080 FPs在1064 nm激发下表现出最显著的荧光强度，约为980 nm激发的2.97倍，是808 nm激发的20.36倍左右。即使在 1500 nm 成像窗口下成像时>HSA@CO-1080 FP 仍保持发光。荧光光谱和一系列体外穿透实验证实，HSA@CO-1080 FP在1064 nm激发下表现出显着的NIR-II亮度和穿透深度（图1）
图2. 使用HSA@CO-1080 FP的高性能NIR-II淋巴造影和血管造影
本文研究了 HSA@CO-1080 FP 进行 NIR-II 淋巴造影的能力。HSA@CO-1080 FPs在1064 nm激发下表现出优越的淋巴结定位和淋巴管划定，优于游离CO-1080发色团。值得注意的是，HSA@CO-1080 FPs在>1500 nm成像窗口保持了出色的淋巴成像能力， 与临床ICG相比，HSA@CO-1080 FPs也显示出显著优越的NIR-II淋巴成像能力和更长的时间窗口。NIR-II FPs随后成功应用于图像引导的淋巴结精确解剖和淋巴水肿疾病的高质量可视化（图2b，c）。总而言之，HSA@CO-1080 FP 是下一代 NIR-II 淋巴造影的主要候选者，解决了临床ICG 淋巴造影的缺陷/局限性。
血管对于输送营养和维持全身器官的正常功能至关重要。高质量的血管造影可以帮助外科医生更有效地识别各种器官的血管病变并评估术后血流恢复情况。因此，我们对HSA@CO-1080 FP进行了一系列临床前血管造影研究。如图所示。2d–f、HSA@CO-1080 FP 与 CO-1080 发色团相比，表现出卓越的全身和局部（腿部）血管 NIR-II 成像能力。将成像窗口切换到更长的波长，进一步提高了成像质量，特别是在>1400 nm和 > 1500 nm 成像窗口中，几乎没有皮肤/背景信号干扰。此外，1064 nm 激发实现了更突出的组织穿透深度和空间分辨率，进一步突出了 HSA@CO-1080 FP 优于 CO-1080 染料的优势。正如预期的那样，HSA@CO-1080 FPs可以实现对血管的多/长期监测，不受任何皮肤信号的明显干扰，这也充分证实了HSA@CO-1080 FPs长期检测/追踪血管相关疾病的能力。
由于血管夹层的多样性和穿支皮瓣设计的复杂性，术后灌注下常导致缺血缺氧引起的局部坏死，使皮瓣坏死成为皮瓣手术最常见和最严重的并发症。不幸的是，目前还没有合适的成像技术来准确和无创地监测皮瓣功能。HSA@CO-1080 FP 成功地在术后对改良的穿支皮瓣模型进行了高对比度的实时监测，以模拟临床皮瓣移植。与正常大鼠不同，HSA@CO-1080 FPs能够清晰地显示皮瓣模型的术后恢复情况，并准确定位缺血性坏死区域（图2g）.静脉注射HSA@CO-1080 FPs，仔细观察皮瓣区域的血路，发现两条预留的臀下动脉（IGA）穿支血管先亮起，然后逐渐向上扩散。与建模前的成像结果相比，皮瓣模型组观察到阻塞血管的打开和血运重建（图2h）。由于背景信号低和排泄快（能够重复观察），HSA@CO-1080 FP成功地可视化了整个皮瓣模型的进展。NIR-II成像证实，进展大致可分为三个阶段：术后第2天，远端皮瓣出现明显肿胀，转为深紫色，并开始出现缺血性坏死。术后第4天，远端皮瓣坏死区加重，呈深褐色。术后第7天，远端皮瓣出现黑色结痂，伴有干性坏死，与近端有明显的分界。 HSA@CO-1080 FPs共同具有优异的NIR-II血管造影能力，可促进NIR-II荧光成像技术的早期临床转化，并提供一种无创有效的监测皮瓣功能的方法。
实时多通道NIR-I/II成像系统可同时记录多个事件，可洞察疾病发生机制，提高成像效率，具有较高的体内和临床适用性。多种生物事件的集成荧光成像依赖于非串扰荧光探针。本文构建了仿生NIR-I FP（HSA@IR-808和β-LG@IR-780），并将它们与NIR-II FP（HSA@CO-1080和DIII@CO-1080）相结合（图3a）。合成的NIR-I和NIR-II FP分别在808 nm和1064 nm激发下实现了非重叠发射，提供了优异的双色成像潜力（图3b–d）。随后，使用NIR-I和NIR-II FP进行了一系列体内多通道生物成像实验。首先，使用HSA@IR-808 FP和HSA@CO-1080 FPs成功实现了集成的多通道NIR-II淋巴成像（图3e-g）. 这些NIR-I/II FPs成功地实现了肿瘤浸润前哨淋巴结的精确共定位，从而指导术中有效的手术切除（避免不必要的切除）（图3f，g）。使用 HSA@IR-808 FP 和 HSA@CO-1080 FP 也实现了无串扰的血管和淋巴系统的集成 NIR-II 生物成像（图3h），这对于精确的成像引导手术很重要。HSA@CO-1080 FPs（肝胆排泄）和 β-LG@IR-780 FPs（肾排泄）的组合可以同时可视化两种药代动力学途径，而不会出现串扰问题。综上所述，基于仿生策略构建的NIR-I/II荧光蛋白具有出色的多色生物成像应用潜力，有望实现多种生物事件的综合实时成像，更好地辅助临床医生处理复杂疾病。
图3. 用于多色活体成像的仿生NIR-I/II FP
鉴于仿生荧光蛋白具有出色的双色成像特性，下一个目标是扩展成像功能以包括其他颜色。为此，我们选择了HSA@Cy5，β-LG@IR-780 FPs，REMP（NaYbF4：Ce， Er@NaYF4：Gd、Yb@PAA） 和 HSA@CO-1080 FP 作为多色生物成像的候选者。体外成像和紫外吸收/荧光数据一致证实，4种选定的探针符合四色成像条件，在最合适的激发/发射通道下，可以实现明亮的发光和最小的串扰干扰. 我们进一步验证了这些探针的多色体内成像能力。(图3j)。静脉注射β-LG@IR-780 FP，然后胃内注射 RENP 和腹腔注射 HSA@Cy5，最后静脉注射 HSA@CO-1080 FP。四个通道（660 nm Ex、808 nm Ex、980 nm Ex 和 1064 nm Ex）的相对荧光信号贡献有助于确定每个探针的生物分布，与每个相应单通道中可视化的图像一致。总体而言，NIR-I/II FP的加入使NIR四色体内实时生物成像成为现实，有望更好地了解生物体的奥秘和疾病的机制。
结论
本文展示了一种用于开发近红外荧光蛋白的传统基因编码技术的替代方案。该方案中的仿生方法既简单又有效，填补了目前NIR-II FP局限性的重要空白，为基于荧光蛋白的生物成像开辟了机会。通过筛选大量具有不同最佳激发/发射波长的寻蛋白NIR-I/II 花青染料作为发色团来构建荧光蛋白，成功地实现了多通道成像系统，从而为各种生物事件的综合监测提供了可能性。持续开发具有更多无串扰的发射带和更长的发射波长（例如，> 1400 nm）的花青染料将进一步增强我们仿生荧光蛋白策略的巨大潜力。更重要的是，这种仿生蛋白质策略还将为设计更多用于原位蛋白质靶向目的的染料提供基本原理。
参考文献
Xu, J., Zhu, N., Du, Y. et al. Biomimetic NIR-II fluorescent proteins created from chemogenic protein-seeking dyes for multicolor deep-tissue bioimaging. Nat Commun 15, 2845 (2024).
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