体内多路分子成像的生物相容性和水溶性短波红外发射花青类荧光探针
本文要点：将分子成像扩展到短波红外（SWIR，900-1400 nm）区域，可以对生命系统中的生物分子进行深层组织可视化。目前只有吲哚菁绿（ICG）及其类似物被批准用于生物医学应用，但小于 800 nm 的激发波长限制了这些探针的深层组织穿透和非侵入性荧光成像。在此，介绍了基于ICG的π共轭延伸花青染料，合成ICG-C9和ICG-C11作为生物相容性，以及发射波长分别为922和1010 nm的水溶性SWIR发射探针。此外，还合成了基于 ICG、ICG-C9 和ICG-C11 的荧光标记剂，用于开发 SWIR 分子成像探针。使用 ICG、ICG-C9 和ICG-C11，通过可视化活小鼠的表面受体（EGFR 和HER2）和肿瘤脉管系统来演示乳腺肿瘤的三色 SWIR 荧光成像。此外，本研究展示了使用 ICG 偶联的抗癌药物 Kadcyla 和 ICG-C9 或 ICG-C11 偶联膜联蛋白 V 对乳腺肿瘤凋亡进行双色 SWIR 荧光成像。最后，我们展示了Kadcyla诱导的乳腺肿瘤缩小的长期（38天）SWIR荧光成像。本研究为使用生物相容性和水溶性SWIR发射探针进行多重荧光分子成像提供了一般策略。
然而，当ICG用作SWIR荧光团时，其激发波长被限制在800nm以下。对于多路复用SWIR荧光成像，需要具有更长激发和发射波长的ICG类似物。增加花青染料聚亚甲基链中一个双键的长度有助于将其吸收和发射最大染料转移到大约 100 nm 的波长。因此，我们合成了π共轭扩展的ICG类似物ICG-C9和ICG-C11，它们在水相中的发射波长分别以922和1010nm。此外，基于 ICG、ICG-C9 和 ICG-C11 合成了SWIR 荧光标记剂，用于 SWIR 区域的多色荧光分子成像。尽管在合成SWIR荧光探针方面付出了巨大努力，但适用于生物医学研究的多路SWIR荧光分子成像技术尚未完全建立。本研究旨在提出一种可用于生物医学应用的多路复用SWIR分子成像的通用策略。使用与 ICG、ICG-C9 和 ICG-C11 的抗体偶联物，我们通过可视化表面受体（表皮生长因子受体 （EGFR））来演示乳腺肿瘤的多重 SWIR 荧光分子成像和人表皮生长因子受体 2 （HER2）和活小鼠的肿瘤脉管系统。此外，本文演示了使用 ICG 偶联的 Kadcyla（曲妥珠单抗 emtansine）对肿瘤凋亡进行多路 SWIR 荧光成像和 ICG-C9（或 ICG-C11）偶联膜联蛋白 V。最后，我们展示了使用 ICG-C9 偶联的 Kadcyla 的 SWIR 荧光对乳腺肿瘤缩小进行长期（38 天）成像。通过展示SWIR荧光分子成像，我们的研究结果表明，ICG和基于ICG的π共轭延伸的花青染料应该是生物医学应用的标准SWIR荧光团。
图1. ICG、ICG-C9 和 ICG-C11 的光学特性
本文合成了两种π共轭延伸的花青染料，ICG-C9和ICG-C11，作为ICG类似物用于多路复用SWIR荧光成像。ICG-C9 和ICG-C11 的π偶联长度比 ICG 中的双键长 1 倍和 2 倍。由于花青染料的最大荧光随着聚亚甲基链中一个双键的增加而增加约 100 nm，ICG-C9 和ICG-C11 可以发射的波长分别比 ICG 长约 100 或 200 nm。
二甲基亚砜 （DMSO） 中 ICG 的最大荧光为830 nm，而 DMSO 中 ICG-C9 和 ICG-C11 的荧光最大值分别为 955 nm 和 1078 nm（图 1b）。与DMSO中的荧光光谱相比，ICG、ICG-C9和ICG-C11在水中的荧光光谱显示出25-68 nm的蓝移（图1c）。在水相中，ICG、ICG-C9 和 ICG-C11的吸收光谱（图 1b、c）显示肩峰的吸光度增加（DMSO 中 ICG、ICG-C9 和 ICG-C11 的吸光度分别为 730、805 和 902 nm）。这一发现表明，聚集的花青染料种类的量在ICG
尽管ICG、ICG-C9和ICG-C11在纯水中的荧光发射非常微弱，但在BSA存在下它们的荧光发射明显改善。因此，我们使用含有 BSA 的 ICG、ICG-C9 和ICG-C11 水溶液进行 SWIR 荧光成像。使用三个带通滤光片（900 ± 25、1000 ± 25 和1100 ± 25 nm）在 785、905 和 975 nm 的不同波长下激发，检查 ICG、ICG-C9 和 ICG-C11 在水相 （1% BSA） 中的荧光亮度（图 1d）。当ICG、ICG-C9和ICG-C11的水溶液（1%BSA）在785 nm处被激发时，仅观察到ICG在900 nm处的SWIR荧光发射。在 905 nm 激发时，ICG-C9 和ICG-C11 在 1000 nm 处观察到 SWIR 荧光发射。相反，当溶液在975 nm处激发时，ICG-C11发射了1100 nm处的SWIR荧光发射。这些结果表明，使用ICG（Ex：785 nm/Em：900 nm）和ICG-C9（Ex：905 nm/Em：1000 nm）或ICG（Ex：785 nm/Em：900 nm）和ICG-C11（Ex：975 nm/Em：1100 nm）的组合，可以实现多路复用SWIR荧光成像。ICG、ICG-C9 和 ICG-C11在 DMSO 中的荧光量子产率分别为 13%、4.3% 和 2.1%。而ICG、ICG-C9和ICG-C11在水中（1%BSA）的含量分别为3.4%、1.2%和0.12%（图1e）。
接下来，本文研究了 ICG、ICG-C9 和ICG-C11 在水（1% BSA）中的水稳定性。尽管菁染料ICG、ICG-C9和ICG-C11在水溶液中不稳定。但由于与BSA络合，BSA的存在显着提高了它们的化学稳定性（图1f）。检测了 ICG、ICG-C9 和 ICG-C11 在785、905 和 975 nm 激光器 （20 mW/cm） 下的光稳定性（图 1g）。我们观察到，用激光照射 60 分钟导致 ICG （30%）、ICG-C9 （25%） 和 ICG-C11 （20%） 发生光漂白。
通过测量三种花青染料的时间分辨荧光衰减曲线，检查了它们的荧光寿命。PBS（1% BSA）中ICG、ICG-C9和ICG-C11的所有荧光衰减曲线均可拟合到一条指数曲线上，ICG、ICG-C9和ICG-C11的荧光寿命分别为0.80、2.7和7.1 ns（图1h）。
图2. 合成 SWIR 荧光标记剂、N-羟基琥珀酰亚胺酯 （NHS）、马来酰亚胺和 ICG、ICG-C9 和ICG-C11 的炔烃衍生物
作为SWIR荧光标记剂，我们合成了ICG、ICG-C9和ICG-C11的N-羟基琥珀酰亚胺酯（NHS）、马来酰亚胺和炔烃衍生物（图2a，支持信息，方案S4-S10）。(6,43)与ICG、ICG-C9和ICG-C11偶联抗体的制备方法如图2b所示。合成SWIR荧光标记剂的详细方案和程序在支持信息中进行了描述。虽然荧光标记剂ICG-NHS，(43)ICG-马来酰亚胺和ICG-炔烃是市售的，其表征尚未报道。在这里，我们描述了ICG-马来酰亚胺和ICG-炔烃的合成和表征（支持信息，方案S4和S5）以及ICG-C9和ICG-C11的马来酰亚胺和炔烃衍生物。荧光标记剂ICG-C9-NHS是通过化合物6和NHS之间的酯化反应获得的（支持信息，方案S6）。化合物6与1-（2-氨基乙基）马来酰亚胺盐酸盐与丙炔胺的缩合反应分别得到ICG-C9-马来酰亚胺和ICG-C9-炔烃（支持信息，方案S7和方案S8）。类似的缩合反应用于合成ICG-C11-马来酰亚胺和ICG-C11-炔烃。
本文使用 ICG、ICG-C9 和ICG-C11 的 NHS、马来酰亚胺和炔烃衍生物对抗体分子进行 SWIR 荧光标记（图 2b）。NHS衍生物用于标记整个抗体分子中的氨基。马来酰亚胺衍生物用于标记还原抗体分子中的巯基。最后，利用炔烃衍生物基于点击化学标记抗体分子，其中叠氮化物基团被引入抗体分子中（图2b）。SWIR染料抗体（赫赛汀）偶联物的吸收和荧光光谱如图2c所示。ICG-Ab、ICG-C9-Ab和 ICG-C11-Ab（Ab：赫赛汀）分别在 820、921 和 1039 nm 处观察到最大荧光。根据SWIR花青染料的消光系数，ICG-Ab、ICG-C9-Ab和ICG-C11-Ab的抗体/SWIR染料标记率分别为0.5、0.8和1.1。ICG、ICG-C9 和 ICG-C11在水中的最大摩尔消光系数为14.7×104， 9.55 × 104和 5.48 × 104M–1cm–1。与 ICG-Ab 和 ICG-C9-Ab 相比，ICG-C11-Ab 的标记率更高可能是由于 ICG-C11 的疏水性更高，导致 SWIR 染料对抗体分子的可及性增加。
本文对活体小鼠的乳腺肿瘤进行了SWIR荧光成像。通过将EGFR阳性的人乳腺癌细胞（MDA-MB-468）移植到裸鼠中来制备携带乳腺肿瘤的小鼠。将ICG-NHS-Erbitux、ICG-C9-NHS-Erbitux和ICG-C11-NHS-Erbitux静脉注射到小鼠体内，并在所有注射ICG-NHS-Erbitux、ICG-C9-NHS-Erbitux或ICG-C11-NHS-Erbitux的乳腺肿瘤中检测到肿瘤的SWIR荧光发射（>1000nm）（图3b中第4天的左图）。在SWIR荧光成像中，ICG、ICG-C9和ICG-C11分别在785、905和975 nm处被激发。由于组织自发荧光较低，具有较长波长（ICG-C9 为 905 nm，ICG-C11 为975 nm）的激发具有较低的背景信号优势。乳腺肿瘤的离体图像清楚地表明，SWIR染料-Erbitux偶联物在乳腺肿瘤中显着积累（图3b中的右图）。
此外，使用由 ICG、ICG-C9 和ICG-C11 的马来酰亚胺和炔烃衍生物制备的 SWIR 染料-Erbitux偶联物对携带乳腺肿瘤的小鼠进行了 SWIR 荧光成像。与注射SWIR染料-NHS-Erbitux偶联物的小鼠一样，在注射SWIR染料-（马来酰亚胺或炔烃）-偶联的Erbitux的小鼠中观察到来自乳腺肿瘤的显着SWIR荧光发射（图3c，d）。这些结果还支持 SWIR 染料-（马来酰亚胺或炔烃）偶联的 Erbitux 在 EGFR 阳性乳腺肿瘤 （MDA-MB-468） 中的积累。
图4. 乳腺肿瘤的多重SWIR荧光分子成像
为了实现多路复用SWIR荧光成像，选择ICG（Ex：785 nm）和ICG-C9（Ex：905 nm）或ICG（Ex：785 nm）和ICG-C11（Ex：905或975 nm）的组合来进行双色SWIR荧光成像。ICG、ICG-C9 和 ICG-C11在 785、905 和 975 nm 处激发时的荧光强度总结在图 4d 中。
对于两种表皮生长因子受体EGFR和HER2的SWIR荧光分子成像，我们制备了两种类型的乳腺荷瘤小鼠（KPL-4和MDA-MB-468）。在KPL-4细胞移植小鼠中，使用ICG-PD-L1（红色，Em：1000nm）和ICG-C11-赫赛汀（绿色，Em > 1050nm）的双色SWIR荧光发射对乳腺肿瘤进行清晰成像（图4g）。移植MDA-MB-468细胞的肿瘤小鼠（PD-L1阳性和EGFR阳性，图4e）的双色SWIR成像也成功。使用ICG-PD-L1（红色，Em：1000nm）和ICG-C11-Erbitux（绿色，Em：1100nm）进行成像（图4小时）。
此外，我们进行了三色SWIR荧光成像，以可视化KPL-4移植小鼠的两种表面受体（HER2和EGFR）和肿瘤脉管系统（图4i）。使用三种类型的SWIR荧光探针（ICG-赫赛汀，ICG-C11-Erbitux和ICG-C9）进行成像。ICG-赫赛汀注射后 1 天进行 HER2 的 SWIR 荧光成像。在 KPL-4 细胞移植肿瘤中观察到强烈的 SWIR 荧光发射（Em：900 nm，Ex：785 nm）（图 4i 中第 2 天的红色图像）。注射 ICG-C11-Erbitux 后，在肿瘤中还观察到 ICG-C11-Erbitux 的 SWIR 荧光发射（例如：905 nm，Em > 1050 nm）（图 4i 中第 3 天和第 4 天的绿色图像）。红色和绿色通道的合并图像清楚地显示了 HER2 和 EGFR 在 KPL-4细胞移植乳腺肿瘤中的共定位。最后，我们进行了肿瘤新生血管系统的成像(50)通过将ICG-C9（含有1%BSA的PBS中的0.1mM）注射到肿瘤小鼠中（图4中第4天的青色彩色图像i）。ICG-C9 用 905 nm 激光激发，并使用 1000 nm 带路径滤光片检测其荧光发射。尽管用 905 nm 光照射会激发 ICG-C9 和 ICG-C11-Erbitux，但 SWIR 荧光主要在 ICG-C9 中观察到。这是因为注射到小鼠体内的ICG-C9（200μL0.1mM PBS溶液）的量远大于ICG-C11-Erbitux（100μL1μM PBS溶液）的量。HER2和血管的合并图像显示，KPL-4移植小鼠的肿瘤脉管系统是在乳腺肿瘤周围发育的。
图5. 肿瘤凋亡的SWIR荧光成像
对于肿瘤凋亡的体内成像，我们制备了细胞凋亡检测探针，即SWIR染料偶联的膜联蛋白V，使用ICG-NHS、ICG-C9-NHS 和ICG-C11-NHS（图 5a）。SWIR染料偶联的膜联蛋白V（ICG-Annexin V、ICG-C9-Annexin V和ICG-C11-Annexin V）的吸收光谱证实了ICG、ICG-C9和ICG-C11与膜联蛋白V分子的偶联（图5b）。
将 KPL-4 细胞与和不与 Kadcyla 一起孵育 3 天。在与 Kadcyla 一起孵育的 KPL-4 细胞中检测到 ICG 偶联膜联蛋白 V 的荧光信号，但在对照细胞（与无 Kadcyla 一起孵育）中未检测到。这些结果表明，ICG-Annexin V可用作活细胞中的凋亡检测探针。
在静脉注射Kadcyla的KPL-4细胞移植肿瘤小鼠中进行肿瘤凋亡的SWIR荧光成像。注射Kadcyla后1天，将ICG-Annexin V注射到小鼠体内，通过检测肿瘤中ICG-Annexin V的SWIR荧光（>1000 nm）进行SWIR荧光成像。与对照小鼠（Kadcyla−）相比，注射Kadcyla的小鼠（Kadcyla+）表现出来自乳腺肿瘤的强烈SWIR荧光发射，表明Kadcyla诱导肿瘤凋亡（图5d）。对两只小鼠（Kadcyla +和Kadcyla−）的肿瘤离体图像的比较清楚地表明，在注射Kadcyla的小鼠中诱导了肿瘤凋亡（图5d中的右图）。
为了确认 Kadcyla 诱导肿瘤凋亡，我们使用 ICG 偶联的 Kadcyla （ICG-Kadcyla） 和 ICG-C9-Annexin V 或 ICG-C11-Annexin V 进行双色 SWIR 荧光分子成像。ICG-Kadcyla（红色）和ICG-C9-（或ICG-C11-）膜联蛋白V（绿色）的合并图像显示了Kadcyla和膜联蛋白V在乳腺肿瘤中的共定位（图5e，f中上图的右图）。这表明 Kadcyla 诱导的 KPL-4 移植裸鼠的肿瘤凋亡。相比之下，对照小鼠（注射无Kadcyla）没有显示来自肿瘤的ICG-C9-Annexin V或ICG-C11-Annexin V的SWIR荧光发射（图5e，f中的下图图像）。
图6. ICG-C9-Kadcyla诱导的乳腺肿瘤缩小的长期SWIR荧光成像
最后，本文研究了花青染料的SWIR荧光是否可用于体内肿瘤凋亡的长期成像。为了监测抗肿瘤药物Kadcyla诱导的肿瘤凋亡，我们通过用ICG-C9-NHS标记Kadcyla来制备ICG-C9偶联的Kadcyla（ICG-C9-Kadcyla）。在注射ICG-C9-Kadcyla的乳腺肿瘤（KPL-4）小鼠中进行长期SWIR荧光成像。在ICG-C9-Kadcyla注射后2-38天采集SWIR荧光图像（图6a）。注射Kadcyla后约1个月，乳腺肿瘤的大小减小了12倍（图6b，c），表明Kadcyla诱导的肿瘤缩小显著。此前，我们报道了使用 ICG-赫赛汀和 ICG-C11-膜联蛋白 V 分别对肿瘤凋亡进行 9 天和 15天的长期成像。目前使用ICG-C9-Kadcyla的结果，加上早期报道的结果，表明ICG-C9的SWIR荧光发射以及ICG和ICG-C11的SWIR荧光发射适用于活小鼠肿瘤凋亡的长期成像。
结论
本文开发了π共轭延伸的花青染料，ICG-C9和ICG-C11。SWIR成像技术的重要特点是使用在SWIR区域发射的生物相容性和水溶性花青染料ICG-9和ICG-C11。ICG-9 和 ICG-C11 可以在大约 900 和1000 nm 处激发，从而实现多色 SWIR 荧光成像。使用ICG、ICG-C9 和 ICG-C11 的抗体偶联物，我们展示了 HER2 阳性和 EGFR 阳性荷瘤小鼠表面受体和肿瘤脉管系统的多路 SWIR 荧光成像。此外，还展示了抗癌药物Kadcyla诱导的乳腺肿瘤缩小的长期（38天）SWIR荧光成像。
参考文献
Swamy M M M, Murai Y, Monde K, et al. Biocompatible and Water-Soluble Shortwave-Infrared (SWIR)-Emitting Cyanine-Based Fluorescent Probes for In Vivo Multiplexed Molecular Imaging[J]. ACS Applied Materials & Interfaces, 2024, 16(14): 17253-17266.
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