骨靶向造影剂P800SO3-PEG应用于近红外成像

期刊名称：Biomaterials Research

原文标题：Renal clearable bone-targeted contrast agents for theranostic imaging

作者：Haoran Wang，Homan Kang，Kai Bao*，Hak Soo Choi*，et,al.

发表单位：沈阳药科大学无涯创新学院；Massachusetts General Hospital

发表时间：2022年8月

DOI：https://doi.org/10.21203/rs.3.rs-1889233/v1

研究背景

近红外(NIR)荧光成像技术是近年发展起来的新技术，由于近红外光的吸收和散射较低，是用于检查骨折、骨损伤和关节异常等骨疾病理想的成像窗口。

哈佛大学医学院与麻省总医院Kang博士/Hak Soo Choi博士研究团队基于结构固有靶向性(SIT)策略，对某种NIR-I区荧光染料进行了修饰，使其能够同时在NIR-I和NIR-II区各有一个峰值，被用于活体体内成像。

2022年10月发表于《Biomaterials Research》，我们对文章中近红外荧光成像的有关应用进行解读，为活体成像实验提供更多的参考。
研究方法

研究人员用硫取代中间碳原子，合成了骨靶向近红外荧光团，发生红移并增加了荧光强度。对新合成的骨靶向近红外荧光团水溶液依次进行了物理化学、光学和热稳定性的研究。在动物模型中进行了钙结合、骨靶向特异性、生物分布、药代动力学、2D和3D荧光断层扫描成像。

动物模型

CD-1小鼠（6-8周龄，雄性）、NCr Nu/Nu裸鼠（6周，雄性）在成像前5天喂食无叶绿素的鼠粮，以减少自发荧光。为了研究体内分布和清除情况，配置0.25-1.0mM近红外荧光团注射用液。

成像前4h异氟醚麻醉，眼静脉丛注射近红外荧光团100μl (25-100nmol)。NIR荧光成像后处死小鼠，取心、肺、肝、胰腺、脾、肾、十二指肠、小肠和肌肉等主要器官，进行组织成像。

近红外荧光成像

为了评价骨靶向能力、体内分布以及肾脏清除率。20g CD-1小鼠经静脉注射50nmol (2.5mg/kg) P800SO3-Cl、P800SO3-SH和P800SO3-PEG；注射4h后，移除所有内脏器官，仰卧姿势固定，进行全身骨成像。

为了评价P800SO3-PEG骨靶向结合稳定性。NCr Nu/Nu裸鼠，眼静脉丛注射P800SO3-PEG 50nmol (2.5mg/kg)，利用NIR-II区成像和NIR-I三维荧光断层扫描成像系统分别进行两次成像，分别观察骨信号随时间的动态变化。

我们对文章中近红外成像设备技术参数进行了整理归纳，见下表：

 

表1.近红外成像设备技术参数设计

NIR-I 区成像		NIR-II 区成像
激发光 (11mW/cm2)	760nm	光纤耦合激发光 (35mW/cm2)	808nm
长通滤光片	785nm	长通滤光片	1070nm
白光	400–650nm	拍摄相机	640×512-pixel
三维荧光断层扫描成像
CT 扫描参数		FLECT 扫描参数
管电压	31 kV	激发光	780nm
管电流	500 µA	滤光片	853nm
曝光时间	150 ms	曝光时间	17.5 ms
360°覆盖扫描	720 帧投影	360°覆盖扫描	116帧投影
图像分辨率	25×25×25 um	图像分辨率	1×1×1 mm
时长	15min	时长	33 min 12s
TriFoil Imaging VivoQuant v2.5:结合CT 、FLECT扫描数据重建三维图像

定量分析

对成像结果感兴趣区域(ROI)，进行荧光/背景的量化。在每个时间点，至少分析三只小鼠，通过Image J计算信号背景比(SBR)。结果用非配对t检验或单因素方差分析(ANOVA)进行统计分析；数据使用Prism9.2.0可视化。

SBR=荧光强度/背景；其中背景是邻近组织的信号强度，如肌肉或皮肤等

骨组织近红外荧光显微镜

为了测定近红外荧光团的骨组织分布，CD-1小鼠注射100ul P800SO3-PEG（50nmol），分别于第1天和14天取小鼠骨组织。修剪解剖骨组织，直接包埋于Tissue-Tek OCT中，-80℃冷冻保存。用冷冻切片机切割10μm的冷冻切片。对切片进行荧光分析后进行HE染色。

设置成像参数：710±25nm的激发滤光片、785nm二向色镜和810±20nm的发射滤光片，调整曝光度和视野成像。

部分研究结果

结构设计与光学性质

与P800SO3相比，其他三组改进的近红外荧光团均显示出明显的NIR-II信号，并且λem随着取代基团能量的减少而增加，能够使荧光尾发射区域从NIR-I延伸到NIR-II窗口(NIR-I：Ex760nm，Em785nm；NIR-II：Ex808nm，Em1,070nm)。

当二磷酸七甲胺中间C原子被取代后，可以有效提高NIR窗口的最大吸收波长和红移系数，增加荧光强度(λemP800SO3=802nm；λemP800SO3-Cl=817nm；λemP800SO3-SH=845nm；λemP800SO3-PEG=847 nm)（图1)。

 

图1.骨靶向造影剂结构设计与光学性质

P800SO3-PEG是NIR-I区花菁染料修饰后，发生红移并增加荧光强度，能够在NIR-I和NIR-II两个窗口进行荧光成像。改善了光学性能，提高了光照敏感性，增强激发后产生的光热效应（图2）。

 

图2.骨靶向造影剂-P800SO3-PEG

骨靶向性和体内分布

CD-1小鼠摘除所有内脏器官后，仰卧姿势进行全身骨成像。结果表明，小鼠的胸椎、腰椎和骶椎，以及背侧肋骨、髂骨和膝关节部位，均表现出很强的荧光信号（图3a，b）。

P800SO3-Cl在肌肉和皮肤中表现出较高的非特异性结合，SBR最低(NIR-I，2.3；NIR-II，3.9)。P800SO3-PEG的背景信号最低，骨靶向结合效果最好；NIR-II窗口组织散射较低，SBR值(SBR≈6.0)显著高于NIR-I(SBR≈3.5)(图3c)。

研究人员比较了P800SO3-PEG在两个NIR窗口成像的分辨率，进行小鼠尾椎骨精细成像(图3d)。可以看到，NIR-II的尾椎骨图像SBR值为2.4，比NIR-I(SBR≈1.3)高2倍左右;FWHM在NIR-II为100±0.01mm（图3e）。

图3.P800SO3-Cl、P800SO3-SH和P800SO3-PEG骨靶向性和体内分布成像

（a）全身骨成像

（b）膝关节成像；color (上)，NIR-I (中)，NIR-II (下）；

（c）骨膝关节及临近肌肉组织的SBR值(n = 3, mean ± S.D)；

（d）尾骨NIR-I和NIR-II成像结果

（e）对图d白色虚线标记的区域进行FWHM 分析

P800SO3-PEG 药代动力学参数测定

研究人员为了评价肾脏清除率，通过对CD-1小鼠眼静脉丛注射P800SO3-PEG（25 nmol），测定血液中P800SO3-PEG动态变化（图4a）

结果表明，P800SO3-PEG的体内分布和清除速度较快(t1/2α=1.53min，t1/2β=21.7min）。此外，P800SO3-PEG曲线下面积(AUC)较小，清除率较高(0.23mL/min)，能够在4h内快速代谢清除(4% ID)。

P800SO3-PEG骨基质结合稳定性

研究人员选用NCr Nu/Nu 裸鼠，静脉注射P800SO3-PEG (50nmol，2.5 mg/kg)后，观察14天内骨基质信号的动态变化(图4b)。

P800SO3-PEG能够靶向结合小鼠的颅骨、肩胛骨、脊椎、髂骨和部分股骨；荧光强度逐渐升高，并在第4天达到峰值；能够稳定与颅骨、脊椎等骨基质结合。

图4c 比较了CD-1小鼠，静脉注射 P800SO3-PEG第1天和14天小鼠的膝盖、颅骨、脊椎和尾椎骨成像，观察骨信号分布随时间的变化（图c）：

1）在膝关节中，骨骺和干骺是骨代谢活跃区域，随着时间的推移，信号减少或消失，并重新分布到胫骨和股骨中。2）生长板（软骨）中没有信号。3)颅骨和上颌骨，边缘轮廓信号随着时间的推移变得更加明显，如脊椎(包括胸椎，腰椎和骶椎) ，髂骨和部分背侧肋骨。4）棘突中的信号逐渐减少，而横突中的信号维持不变。5）裸鼠的精确尾椎骨成像，P800SO3-PEG积聚两周后，每节尾锥表现出明显区分的高信号强度。6）椎间盘（纤维软骨）中没有荧光信号。

第1天的骨纵向分析显微镜结果表明(图4d)，骨表面的荧光信号为软骨(白色箭头)，注射后第14天的成像结果表明，P800SO3能够稳定地融入骨基质中(黄色箭头)。随着时间的推移，游离的P800SO3-PEG沉积在正常骨基质顶部。松质骨的微结构图像分析表明，该区域有着高周转率(即蓝色虚线)或延迟的新骨沉积(无荧光)。

图4.P800SO3-PEG骨基质结合稳定性

（a）P800SO3-PEG药代动力学参数；

（b）P800SO3-PEG在裸鼠体内的生物分布(n = 3, mean ± S.D)；

（c）P800SO3-PEG第1天和14天骨基质NIR-II成像

（d) 切除的骨组织进行H&E和NIR成像

P800SO3-PEG的三维荧光断层扫描成像结果

研究人员通过三维活体断层扫描InSyTe FLECT/CT成像系统，检测了NCr Nu/Nu 裸鼠在静脉注射P800SO3-PEG (100nmol，2.5mg/kg）后第4天，在NIR-I区体内生物分布成像。

FLECT/CT成像结果表明，P800SO3-PEG在注射后4天时表现出明显的骨靶向结合，主要集中在脊椎和骨关节中。

在不同骨组织中，优先积累在骨代谢活跃区域；肾脏残留的弱信号，说明P800SO3-PEG具有稳定快速的肾清除率。冠状位和矢状位图像表明，P800SO3-PEG能够在膝盖、肩胛骨和脊椎中大量积累，未表现出其它组织的非特异性结合。

 

图5.P800SO3-PEG的三维荧光断层扫描成像

（a）活体成像-全身成像；

（b、c）冠状位、矢状位和横截面区域成像

研究结论

P00SO3-PEG 是具有骨靶向的花菁素荧光染料，对骨组织具有较高的亲和力和成像能力，主要器官的非特异性结合最小，激光照射时具有光热效应。P800SO3-PEG是近红外成像的最佳骨靶向造影剂，具有在实时和非放射性骨成像的应用潜力，有坚实的用于诊断治疗临床转化前景。

活体近红外成像在此研究项目中的应用

P800SO3-PEG的荧光发射波长主要集中在NIR-I 区，研究人员对全身骨结构进行NIR-I区的三维荧光断层扫描成像，检测在不同骨组织中的生物分布。

传统小动物2D成像设备做不到文章中无创、实时骨组织NIR-I区荧光成像，是因为组织穿透低，荧光信号会被皮毛、肌肉、血液等背景荧光阻挡。

Trifoil FLECT/CT有效地解决了NIR-I区组织穿透限制这一成像难题，能够对深层组织、器官进行高分辨率成像。通过荧光断层扫描技术，获得真实的三维图像和数据，能够重建骨结构精细图像。同时能够多维度进行ROI区域放大分析，为科研人员提供更高质量的数据。

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