活体成像技术：花青偶联物用于生物医学影像探针的研究

花青（cyanine）是一类具有灵活特性的荧光染料，将cyanine与其他功能分子进行偶联（共价缀合）代表了一类独特的设计策略，在基础和临床成像研究中具有巨大的应用潜力。基于此，北京大学工学院生物医学工程系戴志飞教授团队，对最近7年发表的文献中关于运用cyanine偶联策略进行生物医学影像探针研发所取得的进展进行了总结。我们在此选择一些比较有代表性的概念及成果与大家进行分享：

基于cyanine的荧光探针优势

几种商品化的花青染料（cyanine dyes），如噻唑橙（Thiazole Orange，TO）、Cy5.5、吲哚菁绿（Indocyanine Green，ICG）、IRDye800-CW、ZW800-1，已被成功开发出来（见图1），广泛用于科学研究。

图1：常用cyanine dyes化学结构，红色标记原子表示用于缀合的反应基团。

目前，已有大量围绕cyanine dyes作为荧光骨架而展开的结构修饰与功能化研究，以提高其整体的荧光性能并扩展其成像范围，其中，将cyanine dyes与其他功能性分子进行偶联（共价缀合），是一种直接而有效的方法。

在各种不同光谱特性的cyanine dyes中，Cy5和Cy7是进行共价缀合的优先选择，特别是对于活体成像的应用，其具有在NIR“生物窗”波段（＞650nm）进行成像的多种优势：深层的组织穿透性，较低的光毒性，可有效减少光散射，具有高信噪比（可最大限度地避免由生物样本产生的自发荧光的干扰）。

用于靶向荧光成像的探针

将分析物敏感部位（analyte-sensitive moieties）结合到cyanine dyes支架中、以此获得cyanine化学传感器，是检测小分子物质的首选工具，包括活性物质（活性氧、氮）、生物硫醇（Cys、Hcy、GSH）、无机亲核试剂（N2H4、H2S、CN-）和重金属离子等。这种探针检测模式的主要机制是由分析物引发的反应。
另一方面，许多生物大分子与多种疾病的发生、发展和预后过程密切相关，因此，对于这些目标部位的特异性检测不仅可以促进基础研究，还具有临床应用价值。cyanine与靶向弹头的结合为这些生物大分子的靶向荧光成像提供了强大的可视化工具，其中蛋白质构成了最大的一群目标类型。靶向弹头的分类见图2：

图2：可与cyanine荧光基团结合、用于蛋白质和核酸靶向荧光成像的靶向弹头类型。
蛋白质具有相似的靶向策略，其靶向弹头的范围从传统的抗体、小分子和肽到新兴的核酸适配体、非免疫球蛋白支架。而在核酸方面，相应的靶向弹头主要包括寡核苷酸及其合成类似物（PNA、肽核酸）等。在此仅对抗体偶联探针的情况做详细介绍：

cyanine-抗体偶联探针

抗体具有针对抗原的特异性和敏感性，是一种代表性的靶向弹头。由于抗原涵盖的生物分子范围广泛，包括蛋白质、肽和多糖，因此cyanine-抗体偶联物的适用性非常出色。除全长单克隆抗体 (mAb)外，抗体片段以及双抗、三抗、微型抗体和纳米抗体等也可被用作靶向弹头。其中，较小的抗体片段具有更深的肿瘤/组织穿透性和更快的血液清除率等优点，可以在注射后早期进行高对比度成像，并且其免疫原性也更低。
当前，癌症靶向成像是最具应用前景的领域，研究人员广泛研究了可促进cyanine偶联物在肿瘤中积累的抗原，其中大多数是在癌细胞上过度表达的膜结合抗原：有些是具有癌症特异性的，如结直肠癌和胰腺癌中的癌胚抗原（CEA），乳腺癌和卵巢癌中的人表皮生长因子受体2(HER2)；而其他则是泛肿瘤生物标志物，如表皮生长因子受体 (EGFR)。此外，存在于肿瘤微环境中的抗原也提供了可替代靶点，如血管内皮生长因子(VEGF)。总体而言，cyanine-抗体偶联物可作为基于抗体-抗原相互作用原理的多功能诊断和研究工具。
例如：免疫球蛋白上有大量的活性赖氨酸残基，利用简便的孵育程序，便可促成cyanine NHS-ester与赖氨酸残基之间的偶联反应（图3a）。

图3：a）通过赖氨酸残基方式进行连接的cyanine-抗体偶联物(1-4)。
偶联物1和2分别通过将Cy7 NHS ester与靶向CD20的完全人源化的mAb或与靶向卵巢癌相关抗原OC183B2的小鼠mAb直接偶联而合成；活体近红外荧光成像（NIRF）实验结果表明，它们主要在小鼠异种移植模型的肿瘤和肝脏中积累。
采用类似方法，可将A11微型抗体（一种针对PSCA的人源化抗体片段）与IRDye800CW NHS ester进行偶联，由此产生的偶联物3可成功检测到hPSCA转基因小鼠体内的原发性原位肿瘤和转移性淋巴结。

此外，还可将赖氨酸残基的氨基转化为另一个反应基团用于点击化学（click chemistry），例如，根据中国医学科学院医学实验动物研究所史旭东博士及其同事的报道：利用四嗪NHS ester可得到四嗪修饰的贝伐单抗，通过静脉注射使其靶向VEGF并得以在体内与随后施用的Reppe酸酐标记的Cy5进行生物正交缀合。采用该种策略，研究人员可利用偶联物4、并借助荧光发射计算机断层扫描（FLECT/CT）成像技术，成功地对表达VEGF的结肠癌细胞异种移植物进行可视化观察（图3b）：

图3：b）静脉注射4小时后，在小鼠异种移植模型中捕获的Reppe酸酐-Cy5的FLECT/CT图像，其中，预靶向组使用贝伐单抗-四嗪（偶联物4）预处理24小时，对照组不做预处理。白色箭头示肿瘤区域。

• 多模态成像探针

光学成像，放射成像，X射线计算机断层扫描（CT），磁共振成像（MRI），超声成像以及核医学成像（NM，如正电子发射断层扫描（PET）、单光子发射计算机断层扫描（SPECT））是临床实践中常用的成像模式。多模态成像，如其名称所示，是将互补的成像模式进行集成，以便通过单次成像最大化地获取信息，并弥补各单一成像模式所存在的局限。
NIRF成像模式可避免有害的电离辐射，并有利于获取高灵敏度的实时图像。与CT、MRI、PET、SPECT等其他方式相比，单一的NIRF具有空间分辨率低的局限，因此可以通过共价缀合的偶联方式获取多模态成像造影剂，或针对靶向分子制备多模态成像探针，以解决应用上的挑战。

以cyanine为基础的NIRF可与MRI、NM整合为MRI/NIRF、NM/NIRF类型的多模态成像模式，NM/NIRF还可进一步分为PET/NIRF和SPECT/NIRF，如图4所示：

图4：与cyanine偶联的多模态成像探针举例：MRI/NIRF，PET/NIRF和SPECT/NIRF。
技术聚焦：
基于Cyanine偶联策略可进行生物医学影像探针的研发，包括靶向弹头和其他可用于靶向荧光成像的造影剂以及多模态成像探针。在此过程中，一些新颖的技术手段的运用可以帮助研究人员快速获取更加直观有效的图像和结果，如FLECT/CT技术（提供深部组织的3D荧光信号细节，利于目标部位的精准定位）。我们期待看到cyanine偶联物探针作为生物医学影像诊断工具的应用潜力得到进一步开发，并促进临床转化方面的进展。

期刊名称：Advanced Healthcare Materials
原文标题：Cyanine Conjugate-Based Biomedical Imaging Probes

作者：Yang Li, Yiming Zhou, Xiuli Yue, Zhifei Dai
发表时间：2020
DOI：10.1002/adhm.202001327

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