两种小动物三维活体成像设备核心功能对比白皮书

图1. 组织模拟假体示意图，显示荧光毛细管可放入的位置。

②毛细管：

直径为3 mm的毛细玻璃管，产品信息：WG-3000-4, SP wilmada - labglass, New Jersey, USA。毛细管内填充有30μl荧光染料，可放置于模体内部的不同深度进行荧光成像。

③荧光染料：

吲哚菁绿（ICG），一种水溶性的、已被美国食品药品监督管理局（FDA）批准可应用于临床的近红外荧光染料。

三、实验内容

（1）构建标准曲线：

利用组织模拟假体，分别在IVIS Spectrum CT和InSyTe FLECT/CT设备上对稀释后的ICG溶液进行成像，构建标准曲线。

将含有不同浓度ICG的毛细玻璃管插入模体的P1孔腔中（距离表面深度为12mm），依次进行扫描。
对于InSyTe FLECT/CT设备获取的信号数据，使用VivoQuant（Invicro, Massachusetts, USA）软件进行定量分析；对于IVIS Spectrum CT设备获取的信号数据，使用PerkinElmer Living Image软件包进行定量分析。
用于建立标准曲线的ICG浓度分别为10μM、5 μM、2.5 μM和1.25 μM。

（2）样品处于不同位置时的信号结果比较：

使用IVIS SpectrumCT上的相机采集处于不同角度和方位的样品图像，用于评估信号采集方向的差异对最终重建图像的影响。

将含有2.5 μM ICG染料的毛细玻璃管放置在模体的P2孔腔中（距离表面深度为5 mm），并相对于IVIS Spectrum CT上的相机在不同位置处采集荧光信号。

同样地，在InSyTe FLECT/CT设备中，对同样处于模体P2孔腔的、含有2.5 μM ICG染料的毛细玻璃管进行扫描。对二者的重建图像进行比较。

四、实验结果

（1）使用IVIS Spectrum CT和InSyTe FLECT/CT设备分别构建得到的标准曲线结果如图2所示，并对数据进行最小二乘线性回归分析。利用InSyTe FLECT/CT设备获取的结果呈现几乎完美的线性（R2 = 0.99），表明荧光强度随着染料浓度的增加而相应增加。而利用IVIS SpectrumCT设备获取的结果虽然也是线性的（R2 = 0.85），但线性拟合程度不及InSyTe FLECT/CT。（由于10μM的染料浓度较高，荧光发生自猝灭，其检测结果未纳入这两种设备的线性回归分析中。）

图2. 分别使用InSyTe FLECT/CT（上）和IVIS Spectrum CT（下）设备对连续稀释的ICG染料进行荧光成像，构建标准曲线，并进行线性回归分析。

（2）模体相对于两种成像设备上探测器/相机的位置如图3所示。由示意图可以看出，InSyTe FLECT/CT设备在数据采集的过程中，使用了可以始终围绕样品旋转的探测器机架，这种非定向的测量方式，使得对于样品信号的检测可以不受样品所处方位的影响。而在IVIS SpectrumCT设备中，相机处于固定位置，因此在测量时，样品所处的位置对于检测结果将变得非常敏感。

图3. InSyTe FLECT/CT（左）与IVIS Spectrum CT（右）在数据采集方式上的对比。

图4显示了在不同角度和方位获取的样品信号结果之间的比较，分别使用之前已构建好的标准曲线、根据测定的荧光信号来计算染料的浓度，并与真实的染料浓度（2.5 μM）做比较。

由结果可以看出，InSyTe FLECT/CT获取的信号强度不受样品所处位置的影响，检测到的荧光信号始终是稳定的，据此计算得到的染料浓度（2.2 μM）十分接近真实的染料浓度。而IVIS Spectrum CT检测到的荧光信号受样品所处不同位置的影响较大，不同位置计算得到的染料浓度有较大差异。

图4. 根据InSyTe FLECT/CT（上）与IVIS Spectrum CT（下）在不同位置获取的荧光信号强度，计算得到染料的浓度。

五、讨论与分析

      从构建得到的标准曲线结果来看，IVIS SpectrumCT与InSyTe FLECT/CT设备在精确重建三维荧光数据的能力方面存在显著差距。FLECT/CT的成像结果与模体中荧光毛细管的物理形状和特征非常一致，也显示了预期的来自毛细管的漫射荧光。

     相比之下，IVIS Spectrum CT的成像结果较难解释，因为重建后的荧光信号既不出现在预期的物理位置，其形状也与模体中实际的荧光毛细管不一致。

      对分别利用InSyTe FLECT/CT和IVIS Spectrum CT采集的信号构建得到的标准曲线的定量分析显示，二者的R2值均具有线性。

     其中，InSyTe FLECT/CT的R2值为0.99，具有接近理想状态的线性响应，而IVIS Spectrum CT的R2值为0.85，也具有线性响应。然而，二者之间的线性响应还是有一些不同之处的。对于FLECT/CT获得的数据，系统通过阈值重构荧光体素，在最大值和全宽半最大值（FWHM）之间选择感兴趣区域（ROI），这种方法考虑到了整个重建荧光体积上体素值的变化。对于IVIS Spectrum CT获得的数据，是根据制造商提供的指南选择了一个特定的ROI，该ROI只覆盖了重构荧光的一小部分区域。这种方法将分析结果局限于一个小的ROI内，而不是考虑整个重构体的变化。目前尚不清楚，如果选择了不同的ROI，或对整个重建体积进行分析的话，标准曲线将如何变化。

      样品处于不同位置时的信号测定结果显示，InSyTe FLECT/CT和IVIS SpectrumCT在3D荧光成像性能上的对比更加明显。

     InSyTe FLECT/CT成功重建了P2（5mm位置）处的荧光毛细管，并且，可以根据测定的荧光信号强度，使用标准曲线正确估计出染料浓度。由于InSyTe FLECT/CT采用的是可以围绕样品旋转的检测机架，因此不受样品所处的不同方向和位置的影响（即无方向性，样品处于任何位置时的检测结果均一致）。

      IVIS Spectrum CT的成像结果则显示出设备对于样本方向的敏感性以及严重的局限性。对处于3个方向上的样品，IVIS Spectrum CT的成像都无法做到准确重建，因此也无法正确计算得到毛细管中的荧光染料浓度。这是由于IVIS Spectrum CT在样品成像区域的上方设置了固定位置的探测器，无法有效地在360°范围内获取用于精确重建3D荧光图像的数据导致的。

六、总结

     三维荧光成像是一种重要的临床前研究方法，但由于现有仪器设备的限制，尚未得到充分应用。

     InSyTe FLECT/CT，作为一款专门设计用于实现深部组织成像的临床前成像仪器，能够实现精确的3D荧光成像和定量分析功能，恰如本技术白皮书中演示的结果。

     3D可视化技术提供了进一步定量分析的机会，如对肿瘤大小和体积的变化进行监测，测定治疗药物的分布和浓度，以及用于观测其他的生物现象。

      InSyTe FLECT/CT所使用的 3D荧光成像，可以作为一种补充的技术手段，填补快速型、2D光学成像筛查应用和基于放射性同位素的3D成像（即PET、SPECT）之间的成像技术空白，非常适用于临床前的相关研究项目。

      另一方面，根据中南大学曾文彬教授团队发表的“NIR-I Dye-Based Probe: A New Window for Bimodal Tumor Theranostics”文章中的观点，近红外（NIR）成像已成为肿瘤诊断的有力方法，而将NIR荧光成像与其他成像方式进行结合的双模态成像，能够实现优势互补的协同成像效果，在疾病的诊断治疗中具有巨大的应用潜力。

      基于这种多模态成像的设计理念，除3D荧光成像的功能之外，InSyTe FLECT/CT系统还配备了强大的CT功能，利用CT所具有的空间分辨率高、解剖信息准确、价格相对实惠等优点，与NIR 3D荧光成像的高灵敏度实现成像功能上的高度互补，使检测结果更加接近体内真实情况，同时满足研究人员对精确定位与定量分析的需求。

InSyTe FLECT/CT技术并非全能，它也有很多不足，例如在成像速度和高通量方面就不是优势。

但它确是名副其实的诠释了3D成像、定量、定位的功能；

迄今为止，它为近红外一区成像（活体）提供了相对完美的解决方案：

它拥有针对弱光和深层发光的检测能力；

它为纳米生物学、药物的药效评估（实验动物）和靶向药物的生物学分布提供了新的检测方法；

它是实验动物影像平台的一部分，与生物发光等技术一起共同为生命科学的研究服务。