Nature文章：Inscopix成像研究揭示鸟鸣练习和表演的神经动力学原理

美国杜克大学Richard Mooney、John Pearson等研究人员于2021年10月20日，在Nature上发表了题为“Neural dynamics underlying birdsong practice and performance”的文章，在这项研究中，Richard Mooney等人揭示了鸟类鸣叫练习和表演的神经动力学原理。通过使用Inscopix自由活动钙成像显微镜记录基底神经节中的棘神经（SNs）的活动，发现在唱歌练习期间，基底神经节中的棘神经(SNs)的活动相对于它们的皮层传入是高度可变的。相比之下，在面对雌性的表演中，SN的活动被强烈地抑制，并且在练习过程中抑制SNs，会强烈地减少发声的可变性。

摘  要

音乐和运动技能是通过密集的练习来学习和保持的，以提供准确而可靠的表演。因此，理解这些复杂的行为需要深入了解大脑在练习和表演时的功能。雄性斑胸草雀学会了制作求爱歌曲，这些歌曲在独处时更加多样化，而当面对雌性斑胸草雀时，它们歌声则更加老套。这些差异被认为分别反映了歌曲的练习和表演，为探索神经元如何编码和调节这两种状态下的活动变化提供了一个有用的系统。

研究人员表明，在唱歌练习期间，基底神经节中的棘神经(SNs)群的钙信号相对于它们的皮层传入是高度可变的。相比之下，在雌性出现的表演中，SN钙信号被强烈地抑制，并且在练习中通过光遗传抑制SNs，会强烈地减少发声的可变性。无监督学习方法表明，特定的SN活动模式映射到不同的歌曲练习变体。研究人员确定，去甲肾上腺素能信号通过直接抑制SN活动来减少发声变异性。因此，在练习过程中，SN组合编码和驱动发声探索，而去甲肾上腺素能对SN活动的抑制促进了听众歌曲的定型和精确的表演。
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正  文
成年雄性斑胸草雀在独处时(也就是在练习时)会唱更加多样化的歌，而面对雌性斑胸草雀则会唱更老套的歌，这也是更有效的求偶信号。值得注意的是，基底神经节(BG)特定部位(X区；以下简称为sBG)在这两种状态中是不同的，而sBG病变暂时减少了歌曲的变异性。

1. SNs编码歌唱期间特定的运动相关活动

目前对于“SN组合是如何在实践中编码变异性的，以及它们的活动是如何被动态调节以实现模式化的歌曲表演”还是未知的。为了解决这些问题，研究人员使用Inscopix成像显微镜来成像表达GCaMP7f的SNs，观察这些神经元在成年雄雀自由歌唱时的变化(图1a-c)。当雄性在独自唱歌时，SNs群显示出动态的活动模式，活跃神经元的时间和参与在连续的歌曲演唱中发生变化(图1d)。通过比较神经群中的平均顺序活动和单次的顺序活动来可视化这些动态(图1e)。虽然SN群体的活动是动态的，但它是特定于唱歌的：在运动和其他非声乐运动期间，SNs很大程度上是静默的。而且，SN活动会先于唱歌开始(图1c)，在非唱歌时期对歌曲播放是没有反应，且不受歌唱触发噪声的影响，这表明SNs编码歌唱期间特定的运动相关活动。
 

图1 SN神经群活动是特定于歌曲的和可变的

唱歌相关活动的主要来源是唱歌前运动核HVC中的投射神经元(PNs)。与SNs相比，HVC PNs在1天内的歌曲演唱高峰时间和参与度相对稳定，这与之前的工作一致。因此，在任何一首歌曲的演唱中，HVC PN合奏中与演唱相关的活动模式与整个演唱的平均值相似。因此，在实践中可变的SN活动不是成像伪影或继承自HVC。

2.SN活动导致声音变异性

当雄性从练习转换到面对雌性的歌曲表演时，SNs的活跃度明显下降，大多数SNs中的钙信号低于检测阈值(图2a-c)。这种活跃度的降低与雄性的身体运动无关，也不是光漂白的原因，因为在唱歌过程中，雌性的交替出现会有效且可逆地减少SN的活性。当雄性在唱歌练习和表演之间交替时，HVC细胞及其sBG轴突末端的歌唱相关活动均未发生变化(图2e)。单个SNs的显微成像时，在表演过程中，SN的钙信号受到强烈抑制(图2f, g)。因此，SN总体活性的变化直接平行于歌曲变异性的变化，而这些变化在HVC及其在sBG中的轴突中并不明显。

为了测试在面对雌性的表演中，SN活性的减少是否会导致更刻板的歌声，研究人员分别使用CaMKII或CAG启动子在SNs或sBG神经元中选择性地表达了抑制性视蛋白ArchT。通过组织学证实，苍白球投射神经元中的ArchT表达是由CAG而不是CaMKII启动子驱动的，并且，无论是哪一个启动子，用绿光照亮sBG都强烈抑制了神经活性(图2h)。在无定向歌曲表演的随机子集(15-30%)中，通过光遗传学抑制SN或sBG神经元活动，降低了目标音节的基频(音高)的演唱变异性(图2i, j)。抑制sBG或SN活动也减少了音节内音高变化，这是面对雌性表演的另一个特征。因此，在歌唱练习中抑制SN或sBG神经元的活动可以重现面对雌性歌唱的几个声学变化特征。
 

图2 SN活动导致声音变异性

3. SNs产生的动态活动模式与音高变化有因果关系

斑胸草雀的鸣叫声由几个频谱复杂的音节组成，这些音节被组织成一个有序的序列，或者说是一个主题，这不能简单地用这个单一的指标来概括。因此，研究人员通过模拟sBG合奏活动与实际歌曲主题中的声学结构之间关系来研究歌曲可变性背后的神经编码。作者首先使用了变分自动编码器(VAE)，一种无监督机器学习模型，将声谱图数据(n≈16000像素)压缩到低维(n = 32)潜在表示。这些潜在的维度构成了对歌曲数据的简洁描述，但保留了原始频谱的丰富结构。研究人员发现，具有更多相关感兴趣区（ROI）活动也倾向于具有更高的声学相似性，如通过在VAE学习的潜在空间中较短的距离进行量化，将SN活动模式的变异性与歌曲的变异性联系起来。然后VAE联合建模声谱图和群活性(ROI平均荧光来自每只鸟约60个ROI)。在这里，添加一个全局潜在变量(图3a)来生成对群活动和发声的成对观察，并鼓励这两个已学习的表征在训练中彼此一致。相对于控制模型，该联合编码模型具有正向预测能力(图3b)，表明声学和神经数据之间存在共享信息。此外，当配对、保留的神经和声音数据单独编码并沿着VAE潜在空间中的共享可变性轴投影时，产生的表征比所有情况下随机数据配对产生的表征具有更强的相关性(图3 c, d)。研究人员还检测到歌曲回合中ROI活动、节奏和主题位置之间的关系，以及编码歌曲回合中后续主题数量的单个SNs，这表明SN活动和歌曲之间存在跨多个时间尺度的关系。然而，当将分析限制在一个回合的一个主题时，仍然可以获得积极的预测性能。因此，联合模型的表现并不单单是由于相对缓慢的钙信号和歌曲回合中缓慢的声学结构变化之间的相关性。

接下来，研究人员探讨了神经活动与通过联合模型发现的鸣叫之间的关系。使用模拟的神经-声音数据对来生成对比频谱图和神经活动图(图3d)，描绘了沿着这些共享轴(图3c，品红到绿色)运动的影响。尽管图1中描述了合奏参与和组成的可变性，但该模型学习了选定ROI中的活动水平和特定歌曲特征之间的一组特定关系，表明SN群映射了不同的神经群活动的不同变体映射到声乐输出中可识别的高度结构化变化。
 

图3 SN神经群活动和歌声联系的联合神经-行为的建模方法

实验结论

这些发现表明，LC神经元(sBG的去甲肾上腺素的主要来源)在雄性对雌性唱歌时比独自唱歌时更活跃。

首先，研究人员确认测量sBG中即时早期基因Fos表达的场景差异，并将这一分析延伸到LC中，发现雌性唱歌时Fos表达更高。此外，LC中的Fos表达随社会环境的变化而变化，但与HVC或sBG不同，它不依赖于歌唱频率，这表明它不是简单的面对雌性歌唱的结果。

其次，将SN活动的社会背景依赖性变化与歌曲变异性的状态依赖性变化联系起来。在歌唱练习中，SNs中的钙信号增加，而在HVC PN中的钙信号不增加，在面对雌性的表演中，钙信号被强烈抑制，这让人想起SN中发生的微妙变化，而不是HVC PN在这些状态下的动作电位活动。显然，SNs中动作电位的微小变化与钙内流的大变化相对应，而钙内流的大变化又可能导致基因表达的明显场景依赖性变化。

这项研究还证实去甲肾上腺素抑制SN活动，使发声练习和表演之间的快速转换成为可能，与涉及多巴胺信号的模型相反(尽管不能排除非d1信号)。对于面对观众表演的因素还没有完全理解，但可能包括激励、动机和奖励。更具体地说，去甲肾上腺素信号在紧张和兴奋的情况下会升高，比如在观众面前表演。此外，雄雀对雌雀唱歌时更具有动力，这种动力可以在不失去准确性的情况下提高运动的活力和速度。

求爱是有潜在回报的，而回报情境会抑制运动的变异性。不管这些因素是如何促进唱歌表现的，这项研究结果表明SNs驱动着唱歌的变异性，而不单单是被动地接收皮质-BG通路中其他部位产生的变异信号。此外，虽然sBG之外的区域也有助于歌曲变异性，并提供去甲肾上腺素可以影响歌曲的位点，但鉴于BG是运动表征和强化信号汇聚的位置，从而实现运动学习，确定SNs产生和调节歌曲可变性非常重要。

展  望
跟据实验结果推测，丰富的SNs将使我们能够在毫秒级的时间尺度上探索高维的人声空间。这里使用的联合建模表明，SN神经群活动模式的自然变化可以与鸣声的差异联系起来，揭示了SN活动模式和鸣声变化之间复杂但可识别的映射。因此，SN合奏的动态对练习中的声乐探索有意义的影响，而去甲肾上腺素依赖抑制这些动态使求偶期间的刻板和精确的歌曲表演成为可能。

参考文献:

Jonnathan A, Jack G, Valerie M, William L, Jordan H, Timothy G, John P, Richard M. Neural dynamics underlying birdsong practice and performance, Nature(2021), https://doi.org/10.1038/s41586-021-04004-1

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