生物发光特征与应用

生物发光特征与应用

生物发光（bioluminescence、BL）是指生物体发出的光辐射，是生物体释放能量的一种形式，这种发光现象广泛地分散在生物界中。它不依赖于有机体对光的吸收，而是一种特殊类型的化学发光，也是氧化发光的一种。生物发光的一般机制是：由细胞合成的化学物质，在一种特殊酶的作用下，使化学能转化为光能。自然界具有发光能力的有机体种类繁多。一些细菌和高等真菌有发光现象。动物界25个门中，就有13个门28个纲的动物具有发光现象，从最简单的原生动物到低等脊椎动物中都有发光动物，如鞭毛虫、海绵、水螅、海生蠕虫、海蜘蛛和鱼等。动物的发光，除其自身发光即一次的发光以外，由寄生或共生而产生二次发光的例子也不少。不同生物体的发光颜色不尽一致，多数发射蓝光或绿光，少数发射黄光或红光。

目前，根据发光的机理不同国际上将生物发光分为四种
1．受激荧光是指生物体在受到外界光辐射的作用时，体内固有的荧光物质或吸收的荧光标记物发光的现象。 2．发光生物发光。以萤火虫的闪光为代表。 
3．化学发光 
化学发光是在化学反应过程中(主要为氧化还原反应)发出可见光的现象。化学发光反应是由两个关键步骤组成：激发和发射。许多化学反应进行时能释放足够的自由能而把参加反应的物质之一激发到能发射光的电子激发态，生成一种激发态产物，在它回到基态时，剩余能量转变成光子能量产生发光现象。 
4．生物超微弱发光 
随着生物发光研究的进一步深入，发现人体的器官、组织、细胞、乃至大分子都在发光，不过发光强度更弱。目前研究已涉及到细胞、亚细胞乃至生物大分子的层次。越来越多的实验表明，DNA 是生物超微弱发光的一个辐射源。

生物发光还可分为:
1．被动发光：如植物，那些微弱的红光是没能参与光合作用多余的光，一般的看法是这种光无意义。
2. 主动发光：如萤火虫的闪光。
另外，有些动物本身并不会发光，但在共生的环境中它们会利用发光细菌的光为自己服务。
动物的发光器有两类，一类具有发光细胞，另一类具有共生的发光细菌
发光细胞是起源于皮肤而发生了变异和特化的腺细胞，能分泌荧光素和荧光素酶。           如果发光细胞内同时含有荧光素和荧光素酶，则发光可在细胞内进行，此称细胞内发光；如果发光细胞内仅含有荧光素或荧光素酶，则发光必须在分别含有荧光素和荧光素酶的不同发光细胞之分泌物相遇时才能产生，此称细胞外发光。

生物发光的机制：
荧光素酶（Lu ciferase）以荧光素（Luciferin）、三磷酸腺苷（ATP）和O2为底物，在Mg2＋存在时，底物在催化循环中会形成还原型核黄素磷酸盐和醛化合物，当遇到荧光素酶和氧时，形成一种激发的络合物。络合物断裂时生成氧化核黄素磷酸盐、酸、水及一个光子，化学能转变为光能。
荧光素+ ATP+ O2→核黄素磷酸盐+醛化合物

核黄素磷酸盐+醛化合物→激发的络合物

激发的络合物→氧化核黄素磷酸盐+酸+水+光子

化学能→光能

ATP既是荧光素酶催化发光的必需底物，又是所有生物生命活动的能量来源。在荧光素酶催化的发光反应中，ATP在一定的浓度范围内，其浓度与发光强度呈线性关系。

生物发光的特点： 
1 生物发光的颜色范围很宽，可从红光到深蓝光；
2 氧是几乎所有生物发光系统中必须的因素；
3 生物发光是由“荧光素酶”与“荧光素”的化学反应所引起的；
4 所有的生物发光反应几乎都是酶-底物类型的反应，但复杂程度不同，某些生物发光反应涉及3种或4种底物，而另一些生物发光反应甚至需要3个或4个酶的体系。
5 高效率。在发光的同时，没有辐射热能的消耗，因而生物发光的效率是很高的。几乎能将化学能百分之百地转变为可见光，为普通电光源效率的几倍到几十倍。
6 安全性。因为冷光本身无热，所以没有爆发火花的危险，在油库、炸药库、矿井等易燃易爆场所，用其作照明光源最为理想，因此被称为“安全之光”。

生物发光的应用
1. ATP生物荧光检测
ATP生物荧光检测是基于荧火虫发光机理所设计，荧火虫发光细胞内具有特殊的发光物质-荧光素及荧光素酶，荧光素易被氧化，它在荧光素酶催化下，由ATP激活，使之与氧结合，荧光素分子中的电子跃迁到高能级，处于不稳定的激发态，当电子跳回到低能级时，即发出荧光光子。由于ATP能不断提供能量，因而荧光素分子不断地被激活，即可连续地发出荧光，其荧光强度与ATP浓度在一定范围内成线性关系，通过用发光光度计，可以检测出待测液中ATP含量。该法灵敏度极高，可检测出10μl样品中的ATP含量。研究表明，各生长期的细菌均有较恒定水平的ATP含量，因此，提取细菌的ATP，利用生物发光法测出ATP含量后，即可推算出样品中的含菌量，整个过程仅为十几分钟。由于生物发光法无需培养微生物过程，操作简便、灵敏度高，在短时间内即可得到检测结果，具有其他微生物检测方法无可比拟的优势，是目前检测微生物最快的方法之一 .

2. 利用生物发光蛋白测定细胞内游离Ca2+ 

Ca2+对细胞的代谢与功能的调节作用几乎涉及到细胞的所有生理和生化过程。细胞内游离Ca2+浓度及其分布的变化代表着某种细胞功能的启动、加强和抑制，是形成Ca2+信号的基础。研究Ca2+与细胞功能的关系具有十分重要的意义。利用光蛋白与Ca2+反应极其灵敏的特性，可以测出微量Ca2+的含量。
1967年，Ridgway和Ashley用从水母(acguoreaforskalea)中分离出的一种蛋白质—水母发光蛋白(acguorin)，第一次成功地测定了活细胞内[Ca2+]。水母蛋白与Ca2+结合后激活而发出蓝色荧光(465mm)，在0.1～10μmol/L Ca2+范围内荧光强度与[Ca2+]成正相关，是目前应用最广的一种Ca2+生物发光指示剂。 Ca2+生物发光指示剂不受光漂白效应的影响，对细胞无毒性.  

3应用在免疫检测中进行标记物的超灵敏检测。
BL反应已经被证明是检测酶标记的极为灵敏的方法，依赖于萤火虫荧光素酶热稳定突变体标记的醋酸激酶BL检测可以得到极低的检测极限(8.5x10-23 mol)

4．微孔板上的生物发光
基于超灵敏的光电耦荷装置（CCD）的成像系统，可以同时测量整个384孔板的BL信号。其中每个孔的信号都会通过对BL数字图象进行软件分析得到精确的定量。通过对直观可视信号的评估，测量得到的BL光信号会被转变成假色，而更加突出不同的光强度，如

5. 酶抑制剂筛选
一种BL检测方法可以用来检测蛋白酶活性。水母融合蛋白(配合一个最优的自然蛋白酶酶切位点)被固化在微孔板空内，作为HIV-1蛋白酶的底物。蛋白酶水解键后从固态上释放出水母蛋白，从而增加了BL信号。这个系统可以通过在BL融合蛋白中引入特定的酶切位点而针对不同蛋白酶进行抑制剂筛选。

6．活体动物成像
BL反应所产生的可见光可以部分的透过动物组织，因此可以在整体动物的模式下进行成像。BL全体细胞和分子成像作为一种灵敏、可定量、非侵入性的和实时的方法，可以用来对活体动物进行生物学研究，并将对生物技术、分子医学、基因治疗和药物研发等领域产生深远的影响。

7．体内基因表达 
体内基因表达模式方面的研究。在药物研发领域，科学家通过可发光转基因动物（例如：大鼠或小鼠基因组中整合了修饰的内源基因和BL报告基因）作为人类疾病的模式动物进行目标确认的研究。 例如：目前已经建立了一个转基因小鼠模型，可以监测编码人细胞色素P450 3A4（CYP3A4）基因的体内转录调控，人细胞色素P450 3A4在药物代谢方面起着重要作用。

8．传染性疾病 
疾病的进程和治疗剂的功效可以通过对小鼠注射BL标记进行评估。例如注射经过修饰的病原微生物，然后对透过动物组织的光进行成像。使用这种方法，可以检测活小鼠胃肠道内重组的发光沙门氏菌的定殖和不同的喂食物质对其的影响。

9. 肿瘤研究 
与药物功效研究相同，肿瘤的生长与转移，可以通过活体中注射BL重组肿瘤细胞，再成像进行监测。 另一种方式，初期的肿瘤和不确定的转移可以通过使用基因工程的发光细胞作为探针进行定位。 
a human colon carcinoma xenograft 模式中已经开始使用双标记，一个标记检测特定基因的转录活性，另一个组成性表达，作为一个内参照物。

10. 细胞移植 
心脏细胞移植中胚胎心脏成肌细胞的位置、数量和存活时间可以在活体动物中进行非侵入行的监测。 体内BL成像同样提供了一种新的可以动态检测移植的人造血干细胞的方法。其他的生物学过程同样可以通过BL标记后活体成像进行研究，比如细胞凋亡、蛋白-蛋白互作和效应细胞功能等等。使用这种方法可以在活体中进行客观的、可定量的检测，成为药物筛选的一个重要工具。

11．生物发光传感器 
BL被作为一个检测系统在生物传感器中使用，严格意义上是指作为生物识别系统中的分析装置并与传导装置接触，相关的酶被固定在各种不同形式的装置上。这些系统主要是基于耦连的酶促反应并引发光子的发射。