应用荧光成像技术探究肿瘤相关免疫细胞介导的肿瘤靶向机制

在针对肿瘤的靶向研究方面，花青荧光团所具有的结构固有肿瘤靶向（SITT）特性，由于不再需要与靶向配体进行结合，已越来越受到科学界的关注。然而，SITT背后的靶向机制尚未得到很好的解释。
另一方面，肿瘤组织中含有大量的免疫细胞，包括骨髓来源和/或组织驻留的肿瘤相关免疫细胞（TRICs/TAICs），这些TAICs可以成为癌症检测的主要靶标，但目前尚缺乏对于靶标免疫细胞的小分子荧光基团的研究报道。
在此，我们很高兴可以分享一项来自哈佛大学医学院与麻省总医院Homan Kang博士团队的最新研究成果，受前期在器官及疾病特异性荧光团开发方面的成功经验启发（参见：前沿分享 | 哈佛大学医学院：一种用于靶向治疗GIST肿瘤的非粘性、肾脏可清除纳米平台），该团队设计并合成了一种靶向TAICs的花青荧光团SH1，并利用SH1证实了与SITT相关的肿瘤靶向机制。
在实际应用方面，SH1具有近红外二区（NIR-II，1000-1700 nm）成像能力，能够在活体组织（如骨髓、脑血管和肿瘤血管）内进行深层组织成像，显著降低组织的自发荧光和散射，具有很高的临床适用性；此外，因TAIC介导的肿瘤靶向性，SH1无需与额外的靶向配体偶联即可具有广泛的肿瘤靶向性，展现出高肿瘤-背景比（TBR）。作为一种充满潜力的癌症靶向剂，SH1在术中光学成像和图像引导的癌症手术中将具有巨大的应用前景。

部分实验设计与结果分享如下：

• SITT肿瘤靶向机制探究

将靶向TAICs的荧光团SH1静脉注射到荷瘤小鼠体内，观察到癌变区域的信号并未在早期时间点出现，而是在数小时后突然出现（图1）。与此同时，荧光团在骨髓中的免疫细胞中积累，并随免疫细胞浸润到癌变区域，导致荧光信号强度随时间的推移而增强，信号-背景比（SBR）也显著增强（图1A，C）。此外，利用NIR-II成像的深层组织穿透能力，可在注射后24 h清楚地观察活体小鼠的脊柱、胸骨和后肢中的骨髓（图1C）。据此，推断SH1具有两种不同的肿瘤靶向机制（图1D）：①通过体循环直接到达癌变区域，并且在长达24 h的时间内被肿瘤细胞和肿瘤相关免疫细胞吸收；②被骨髓中的免疫细胞内化后，随免疫细胞浸润到癌变区域。

图1 NIR-II荧光成像和SITT肿瘤靶向机制

（将50 nmol的SH1静脉注射到胰腺导管腺癌（PDAC）小鼠模型中。红色圆圈和虚线表示感兴趣区域。激发光：808 nm，滤光片：1070 nm LP，曝光时间：50 ms。）

A）B）肿瘤组织和脊柱骨髓中信号随时间的变化

C）SH1在脊柱、胸骨和后肢骨髓中的摄取情况

D）SH1荧光团靶向肿瘤的两步机制示意图：

①直接靶向肿瘤细和肿瘤相关免疫细胞；

②被靶向后的肿瘤相关免疫细胞通过血管迁移，浸润到癌变区域。

• 基于花青的SH1荧光团设计

对各种花青荧光团进行体内筛选后，研究人员设计并合成了SH1（图2A），其光学和物理化学性质，如吸光度和荧光光谱、电荷分布和极化率等如图2B-D所示。SH1具有较长的NIR-I区发射波长（最大值820 nm）和NIR-II区发射尾（尾发射高达~1250 nm，这是其具有NIR-II成像能力的关键）。在5% BSA盐溶液中，与市售的NIR-II染料IR-E1050和IR26相比，SH1具有更高的量子产率（SH1：11%，IR-E1050：0.2-2%，IR26：0.05-0.5%）。同时，与吲哚菁绿（ICG，FDA唯一批准的可用于体内NIR-II成像的荧光染料）相比，SH1在NIR-II区具有更高的荧光亮度（225%）。

图2 SH1荧光团设计图示及光学、理化性质

• 评估SH1靶向的细胞类型

利用流式细胞术，评估骨髓和肿瘤TAICs中SH1的靶细胞类型。结果表明，SH1靶向的大多是骨髓中的免疫相关细胞，如巨噬细胞、单核细胞、淋巴细胞、中性粒细胞和树突状细胞（图3）。此外，通过免疫组织化学染色和组织学荧光分析，可以观察到由于靶向免疫细胞的浸润，导致肿瘤组织中的荧光信号显著增加（图3C）。

图3 骨髓和肿瘤组织中SH1靶向的免疫细胞

将SH1、ICG和IR-780注射到LLC荷瘤小鼠体内，SH1可在注射后48 h时在肿瘤区域显示出极好的信号强度，而ICG由于快速被肝胆清除而没有显示出良好的肿瘤靶向性（图4A，C）。IR-780显示出与SH1不同的肿瘤积累模式，在注射后4h左右的早期时间点在肿瘤中积累。

另一方面，研究人员创新地引入了三维（3D）荧光断层扫描（FLECT/CT）成像技术，对注射后24 h和48 h时每种染料在癌症区域的百分比剂量（%ID）进行定量评估（图4G；图5）。结果显示，从注射后24 h到48 h，SH1的%ID增加了2倍以上，这一结果有力地支持了研究人员此前的推断，即随着时间的推移，SH1靶向的TAICs迁移会增强肿瘤-背景比（TBR）。


图4 对LLC荷瘤小鼠进行SH1肿瘤靶向的体内成像，并与IR-780和ICG作比较
A）各染料注射后48 h内进行NIR-II荧光成像；
C）48h内肿瘤部位的信号强度变化；
G）使用兼具x-ray CT功能的3D荧光断层扫描（FLECT/CT）成像技术，对各染料在注射后24h和48 h的肿瘤积累进行相对定量分析。
绿色区域表示用于定量分析的感兴趣体积（VOI），与传统二维成像中的感兴趣区域（ROI）相比，对目标部位进行三维体积层面的数据采集，可以使分析内容更加接近体内真实情况，获得更加准确的定量分析结果，而二维光学成像往往无法满足精确定位与定量分析的需求。

图5 利用3D荧光断层扫描（FLECT/CT）成像技术对肿瘤部位的信号积累进行相对定量分析

A）B）LLC荷瘤小鼠在注射标准样品后24 h和48 h的3D荧光断层图像
（FLECT/CT：一种将三维荧光断层扫描与x-ray CT相结合的多模态成像系统。FLECT扫描：以每层116个投影、780 nm激光激发和853/45 nm带通荧光发射滤光片进行。CT扫描：采用每层360个投影、35 kV管电压、950 μA管电流和100 ms曝光进行。使用VivoQuant图像分析软件对3D荧光图像进行定量分析，且FLECT图像和CT图像可以在VivoQuant软件中互相配准，实现对目标信号的准确定位。）
C）D）对填充有不同浓度梯度（2.5、5、10 μM）的荧光染料标准样品进行连续扫描，并执行上述VOI分析，制作浓度和信号强度曲线，线性回归方程拟合优度（R2）＞0.999，证明FLECT/CT的线性响应性能完全符合要求，定量分析结果准确可靠。
E）定量结果汇总数据。
技术亮点：
通过本项研究，Homan Kang博士团队首次阐明了TAIC介导的肿瘤靶向机制，并利用流式细胞术、组织学、体内NIR-II荧光成像以及新型的3D荧光断层成像（FLECT/CT）技术进行证实。SH1的NIR-II功能允许操作人员观察活体深层组织中的信号，而FLECT/CT技术则可以在获取三维NIR荧光图像的同时，实现准确的定位与定量分析功能。实验过程中，相关的三维成像操作与数据定量分析工作，均由InSyTe™ FLECT/CT系统研发团队的Austin Moy博士（TriFoil Imaging）协助完成，因FLECT/CT成像技术作为下一代分子成像技术、在三维荧光断层扫描与定量分析方面所具有的创新性和先进性，Moy博士也成为本项研究的合著作者之一。

原文标题：Tumor-Associated Immune-Cell-Mediated Tumor-Targeting Mechanism with NIR-II Fluorescence Imaging

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