三维活体成像：新型反义寡核苷酸纳米复合药物靶向作用可视化的研究

利用近红外三维成像技术可视化新型反义寡核苷酸纳米复合药物靶向降压作用研究

研究背景

研究应激性高血压形成的遗传和生理机制，探索预防和治疗应激性高血压的新途径是医学亟待解决的科学问题之一。所有的抗高血压药物都有一些不良副作用，这些副作用有时会成为药物使用障碍。
反义寡核苷酸与靶RNA的互补位点结合形成DNA/RNA双链，阻断RNA功能，使用这些药物可以最大限度地降低毒副作用。此外，寡核苷酸可以快速定向到任何靶点，而寻找新的小分子药物可能需要数年时间。
纳米粒子为核酸类药物进入细胞提供高效便捷的递送系统，俄罗斯科学院西伯利亚分院Asya Levina研究团队，合成了多种纳米复合药物（Si-ODN），通过不同给药途径的降压作用进行药效评价，并对其在体内生物分布的动态变化进行活体三维成像；
相关研究成果2022年8月发表在《Journal of Drug Delivery Science and Technology》。


实验结果

Si-ODN的合成
研究人员合成了多种纳米复合药物，Si-ODN1、Si-ODN2和Si-ODN3分别含有靶向结合AT1A、ADRB1和ACE1的mRNA反义寡核苷酸，随机序列寡核苷酸的Si-SCR1、Si-SCR2、Si-SCR3作为对照组(表1)。
表1.反义寡核苷酸序列信息

建立应激敏感性动脉高血压大鼠模型（ISIAH），通过不同途径给药Si-ODN，如腹腔注射、雾化吸入、静脉注射、口服和心肌注射，第二天尾套法测定收缩压。

AT1A mRNA靶向Si-ODN1的降压作用
随机序列寡核苷酸的Si-SCR1对照组ISIAH大鼠血压没有变化，同时心肌注射和口服给药后血压也无明显变化。静脉注射Si-ODN1后，血压在第三天下降30mm Hg，并在第四天开始上升(图1)。
研究人员利用AT1A受体阻断剂，氯沙坦(临床药物)作为降压作用的比较数据。每天给予氯沙坦(10mg/kg)30天后，ISIAH大鼠血压从183降至150mm Hg。降压效果与Si-ODN1相同。然而，大鼠必须每天用氯沙坦治疗，而单次注射Si-ODN1药效能持续数天。

图 1.静脉注射靶向AT1A mRNA的Si-ODN1纳米复合物后的收缩压.

ADRB1 mRNA靶向Si-ODN2的降压作用
腹腔注射靶向ADRB1 mRNA的Si-ODN2，可使血压在注射后第一天下降约15mm Hg，降压作用至少持续5天(图2a)。静脉注射Si-ODN2在两天内血压下降12mm Hg(图2b)。大鼠心肌内注射Si-ODN2后第二天血压急剧下降(约50mmhg)，两天后血压又回到了最初水平。

图2.腹腔注射和静脉注射靶向ADRB1 mRNA的Si-ODN2纳米复合药物后的收缩压
a：腹腔注射;b:静脉注射

ACE1 mRNA靶向Si-ODN3的降压作用
研究人员使用Si-ODN3和Si-mODN3两种纳米复合药物进行静脉注射给药，Si-mODN3比Si-ODN3更能显著降低血压(治疗后一天内血压分别下降了20和12mm Hg)(图 3)。两种纳米复合药物作用时间都比较长,并保持了一周的显著差异。
已知体内约80%的ACE1是在肺血管内皮中合成的，因此Si-ODN3雾化吸入似乎是有利的。前期实验证明，吸入后一周血压逐渐下降，第7天达到最低值。一直到第15天才回到初始水平。单次吸入时，两周内血压显著下降了22mm Hg。
本次实验中，第一次给药后的初始血压水平（200 mm Hg）和最低血压水平（160 mm Hg）。在第一次吸入后的第5天，血压升高到180 mm Hg（仍低于初始值200 mm Hg），再次吸入Si-ODN3可使血压下降至160 mm Hg。血压值在5天内保持在平均175mm Hg，只有在第10天才开始接近初始值（图4）。因此，影响ACE1基因表达最有效的方法是周期性地吸入Si~ODN3纳米复合药物。
使用卡托普利作为药物对照（舌下）也会降低收缩压（~30mmHg）。然而，当使用反义核苷酸纳米复合药物时，降压效果可以持续数天，而单次给药卡托普利的效果仅持续数小时。

图3.静脉注射靶向ACE1 mRNA的Si-ODN3和Si-mODN3纳米复合药物后的收缩压
光柱：Si-ODN3；暗柱：Si-mODN3
图4.重复雾化吸入靶向ACE1 mRNA的Si~ODN3纳米复合药物后的收缩压

Si-ODN生物毒性的初步研究
通过雾化吸入或腹腔注射给药后，对动物体重、行为和血细胞计数来评价Si-ODN的生物毒性。给药单剂量(60nmol ODN)和双倍剂量(120nmol ODN)后第五天，评估在陌生环境中的活动量，恐惧应激（低温），探索活动(后腿站立，中心区域停留)等实验。此外，腹腔注射Si-ODN1后，第五天检测血细胞。
结果表明，单剂量和双倍剂量的纳米复合药物对大鼠在旷场实验和血细胞含量中无显著差异。这表明纳米复合材料没有明显的毒性，即使剂量增加了两倍。

表3 腹腔注射Si-SCR1后第5天的体重、血压和行为特征
表4.腹腔注射Si-SCR1后第5天，ISIAH大鼠的血细胞计数

Si-ODN3-Cy7.5体内生物分布
荧光标记纳米复合药物
       荧光染料NHS-Cy7.5(750nmol)与含反义寡核苷酸ODN3-NH2(100nmol)在水-二甲基亚砜混合物(1:1,100μl)中，在0.1 M Tris-HCl、pH8.3、4℃反应16h，标记寡核苷酸。
       ODN3-Cy7.5用2% LiClO4丙酮中沉淀，然后用丙酮洗涤两次，溶于50μlH2O中。通过吸光度计算浓度，ODN3-Cy7.5（Amax =788nm)的浓度0.4mM。纳米粒子、寡核苷酸和Cy7.5的终浓度分别为240mM、1.6mM和0.8mM。
动物模型
       用8-9周龄SPF雄性SCID小鼠，作为纳米复合药物体内分布的动物模型。一组静脉注射0.1nmol的Si-ODN3-Cy7.5；另一组雾化吸入0.1nmol的Si-ODN3-Cy7.5，雾化30分钟；两组在给药后0.4、1、3、7和14天进行扫描。为了校正荧光信号，分别将1nmol和0.1nmol的Si-ODN3-Cy7.5溶液分别注射小鼠的两侧股骨肌内，注射后立即进行扫描。三维活体断层成像 ( FLECT )
       使用InSyTe FLECT/CTTM (TriFoil Imaging，Chatsworth，CA，USA) 荧光/x-射线计算机断层扫描成像。
       CT参数:管电压30kV，管电流950μA，曝光时间180ms；采用360°连续旋转扫描技术，360帧投影；图像分辨率为25×25×25μm，总扫描时间为8分钟。
       FLECT参数：使用730nm激发光，853nm滤光片，曝光时间为16ms；360°连续旋转扫描技术，116帧投影；图像分辨率为1×1×1mm，总扫描时间为60分钟。使用TriFoil Imaging软件(chat-worth，USA)重建图像。在VivoQuantv3.0软件(Invicro，USA)中将重建的3D CT和FLECT图像配准融合，使用VivoQuantv3.0定量。

Si-ODN3-Cy7.5 FLECT/CT成像
       静脉注射Si-ODN3-Cy7.5，主要在肝脏和肾脏中积累(图5a和b)。在注射后第一天，荧光累积达到最大值，两周内逐渐从体内代谢清除(图5d)。
       雾化吸入Si-ODN3-Cy7.5，荧光主要在胃肠粘膜积聚，原因是吸入了沉积在鼻咽部的物质。在大脑(下丘脑，垂体)中检测到标记荧光(图 5c)，吸入后第一天，荧光积累达到最大，随后逐渐从体内清除。(图5e)
       在静脉给药的情况下，ACE1靶向纳米复合药物在肾脏中的积累，可以作为降低高血压ISIAH大鼠血压的决定性因素，因为肾脏是肾素-血管紧张素系统的核心器官。吸入纳米复合药物时血压下降的原因，也可能是因为在具有肾素-血管紧张素系统的大脑中积累。

图5 小鼠体内检测标记荧光结果。
靶向ACE1 mRNA的Si-ODN3-Cy7.5经眼眶静脉窦注射(a，b)和吸入(c);肾脏、肝脏(d)和脑(e)中标记荧光的动态变化。
1.眼眶静脉窦; 2.肾; 3.肝;4.肠;5.鼻咽;6.下丘脑和垂体。

研究结论
研究团队提出了一个最佳治疗ISIAH方案，定期雾化吸入靶向 ACE1 mRNA 的寡核苷酸纳米复合药物，同时这种方法恰好也是临床上可能使用的优选方法。

小编寄语
       FLECT/CT作为当前真正实现光学360°扫描的活体成像技术，暂时处于全球小动物三维成像检测设备和定量分析的领导地位，拥有卓越的检测灵敏度，能够提供更高质量、更丰富的实验数据。
       重要的是，通过三维荧光断层扫描，能够无创检测对同一小鼠在不同时间点（0.4、1、3、7和14天），纳米复合药物在肾脏、肝脏和脑中的药物积累（Si-ODN3-Cy7.5×10^-9，mol），进行绝对定量的动态分析，保证了实验的连续性，助力纳米复合药物的靶向作用和代谢清除动态变化等研究。

期刊名称：Journal of Drug Delivery Science and Technology
原文标题：In vivo hypotensive effect of aminosilanol-based nanocomposites bearing antisense oligonucleotides
作者：Asya Levina *，Marina Repkova ,et,al.
发表单位：Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine,Siberian Branch of RAS
发表时间：2022年8月
DOI：https://doi.org/10.1016/j.jddst.2022.103612

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