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miRNA表达的定量分析是生物功能研究的基础，细胞、组织或血液中的miRNA的检测有助于发现新的早期诊断和预测疗效及患者预后的生物标志物。我们提供优质的miRNA实时荧光定量PCR全套技术服务。
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miRNA荧光定量检测服务
miRNA表达的定量分析是生物功能研究的基础，是当今世界生物学研究的热点领域。细胞、组织或血液中的miRNA表达谱的检测有助于发现新的早期诊断和预测疗效及患者预后的生物标志物。我们为您提供优质的miRNA实时荧光定量PCR全套技术服务。
一、miRNA qPCR技术服务项目：
1、 相对定量：以U6 snRNA或5S rRNA为内参，检测样本中相关miRNA的表达量。
2、 绝对定量：以化学合成的miRNA成熟链为标准品，做5个梯度点以上的稀释后制作定量标准曲线，通过标准曲线对待检测miRNA进行绝对定量。
3、 miRNA芯片数据确认：对芯片所筛选目的miRNA进行Real-time PCR数据验证。
二、miRNA qPCR技术服务方法及仪器：
用SYBR Green 等多种常用荧光定量PCR试剂检测表达情况；
检测仪器为Bio-rad CFX96
三、miRNA qPCR技术服务流程：
1、 样品RNA准备
提供样品总RNA，也可提供组织、血液、细胞类样品，需支付样品的前期处理费用。
2、RNA质量检测
紫外吸收测定法测定波长260nm和280nm的吸收值，判断RNA样品的浓度。
3、逆转录合成cDNA
利用茎凸环引物逆转录合成cDNA链。
4、实时荧光定量PCR
以合成的cDNA作为模板进行实时定量PCR扩增（每个样品检测三次，同时检测每个样品中U6 snRNA或5S rRNA含量作为内参，以校正上样误差）。
5、分析结果、提供实验报告
相对定量—分析相对表达参数，提供统计学分析，获得相对表达差异；
绝对定量—依据miRNA标准品制作标准曲线（每条曲线上至少设置5个数据点），以定量样品中的待检测miRNA；
分析实时定量PCR结果，提供实时定量PCR实验数据和扩增曲线，融解曲线，柱状图。
四、miRNA qPCR技术服务样品提供：
a. RNA样品：取10µg总RNA，并提供RNA质量检测图。要求浓度在500ng/µl以上，体积在20µl以上，OD260/OD280的比值在1.8至2.0之间，电泳检测28s的亮度约为18s的两倍。-80℃贮存，干冰运输。
b. 组织样品：请将200mg以上的组织样本，并分装为两管。-80℃或者液氮贮存，干冰运输。
c. 血液样品：请提供至少2mL血样，并在2小时内处理完毕后加入Trizol。
全血：用EDTA等抗凝剂处理后的样本，按每200µl全血加入1ml Trizol的比率加入足量Trizol，涡旋摇匀，放入干冰或者-80℃箱保存，干冰运输。
血浆：用EDTA等抗凝剂处理后的样本，4℃ 4000rpm离心5分钟，上层为血浆样本，按每200µl血浆样本加入1ml Trizol的比率加入足量Trizol，涡旋摇匀，放入干冰或者-80℃冰箱保存，干冰运输。
血清：用非抗凝管收集血样，静置分离上层血清，按每200uL血清加入1ml Trizol的比率加入足量Trizol，涡旋摇匀，放入干冰或者-80℃冰箱保存，干冰运输。
d. 细胞样品：
贴壁细胞
1、 贴壁细胞培养或处理结束后，去除培养液；
2、按每10 cm2 培养面积加1 mL Trizol试剂的比例加入Trizol试剂；摇匀，保证所有细胞接触到Trizol而被充分消化；
3、用1 ml枪头反复吹打, 并将Trizol细胞悬液转移至RNAase-free 的EP管中；
4、 放入干冰或-80℃冰箱中保存，干冰运输。
悬浮细胞
1、悬浮细胞培养或处理结束后，离心去除培养液；
2、保留的细胞用PBS 缓冲液快速洗一次，离心除去PBS 缓冲液；
3、按照每5×106 个细胞加1 mL Trizol的比例加入Trizol试剂，涡旋振荡使细胞充分悬浮；
4、放入干冰或-80℃冰箱中保存，干冰运输。
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