荧光定量PCR分析

基因表达的精确定量是通过ABI7000/7500,罗氏4800实时定量PCR荧光检测系统来实现的，其主要原理是将目的片断扩增到一定量时需要的PCR循环数（Ct）跟加入的DNA模板浓度对数成线性相关。根据检测荧光来源的不同，实时定量PCR可以分为两种，一种是通过Taqman探针来实现，而另一种是通过SYBR嵌入DNA双链发光原理来实现。两种PCR体系都能产生高重复性的实验结果，但Taqman探针的订购需要较长时间。基因表达量的校正有两种方式，一种通过比较候选基因与参照基因达到一定量扩增产物时的Ct值来实现（ΔCt）， 另一种是利用标准样本构建浓度与Ct值相关曲线，分别确定候选基因与参照基因的绝对表达浓度，然后通过比较这两个浓度值来确定候选基因相对参照基因的表达量。前一种方法由于不同基因片断扩增效率不等或扩增效率未知，故不能准确估计目标基因相对参照基因的表达比例，对于后一种方法，可以去除不同基因片断扩增效率不等的影响，而且如果采用标准样本，既可以准确获得目标基因相对参照基因的表达比例，也可以准确知道目标基因在cDNA中的绝对含量。

本公司推荐采用SYBR定量PCR试剂以及利用标准曲线的基因表达校正方法.

以下是该方法简要示意图：

客户需要提供：
1）用1μg DNase I纯化后的总RN反转录后获得的cDNA，一般为20μl体系；
2）需要定量的目标基因以及用于校正的参照基因信息。

我们提供的服务内容：
1）SYBR实时定量PCR试剂的订购；
2）定量PCR引物的设计、合成与优化；DNA样本的质检与标化；
3）目的基因及参照基因的绝对定量PCR；
4）绝对定量数据的整理以及目标基因相对参照基因的表达分析；
提供给客户的结果报告将包括原始数据文件、实验步骤、绝对定量数据以及表达校正结果等
完成期限：
引物的设计、合成及优化需10个工作日；1000个实时PCR反应体系需5个工作日。
检测费用：请来电询价
检测实例：

Gene X 绝对定量界面