蛋白磷酸化修饰分析

   蛋白翻译后修饰（Post-translational modification, PTM）指蛋白经生物合成后的共价修饰及酶学修饰，修饰作用可发生在蛋白氨基酸侧链及其C或N末端，通过对现有20种氨基酸官能团的改造或者引入新的基团（如磷酸基、乙酰基等）来实现其功能的扩展，大多数真核生物所表达的蛋白质需经过一系列的翻译后加工和修饰才能形成最终复杂的功能执行体，因此蛋白质的翻译后修饰成为蛋白质组学研究的重要方面。
翻译后修饰蛋白质在样本中含量低且动态范围广，其相关研究极具挑战性，亲和富集、多维分离等技术与生物质谱的结合为翻译后修饰蛋白质组学的发展提供了契机。目前，已进行规模化研究的蛋白修饰主要有磷酸化（Phosphorylation）、乙酰化（Acetylation）、糖基化（Glycosylation）、泛素化（Ubiquitination）等。

其中蛋白质磷酸化（Phosphorylation）是最常见、最重要的一种蛋白翻译后修饰方式，发生在蛋白质丝氨酸、苏氨酸以及酪氨酸上，它由两个作用相反的酶系——蛋白激酶和磷酸酶进行调控。
蛋白磷酸化修饰分析技术，主要包括蛋白磷酸化鉴定（纯化蛋白磷酸化鉴定/磷酸化蛋白全谱鉴定）和蛋白磷酸化定量。华大基因的蛋白磷酸化定量产品主要包括以下几种。

 

产品名称	产品优势
蛋白磷酸化修饰iTRAQ/IBT/TMT标记定量	一次性比较多个样本，极大地降低了实验误差，提高定量准确性。
蛋白磷酸化修饰 4D-DIA非标记定量	高深度：1h鉴定磷酸化肽段近15,000；高准确性：定量相关性达0.95；多维高精度：同4D-DIA常规蛋白定量强强联合，探索蛋白表达“全景图”。
蛋白磷酸化修饰 PRM靶向定量	采用“full MS+PRM”；PRM list导出成功率高；操作便捷稳定，省去碰撞能量（CE）优化；定量更准确，含更丰富的母离子和子离子信息辅助定量；质控严格，定量时样品间内参磷酸肽的CV小于25%。

    （1）蛋白磷酸化修饰标记定量

       蛋白磷酸化修饰标记定量是基于高精度、高灵敏度质谱仪，将iTRAQ/IBT/TMT定量技术与TiO2富集技术相结合，对生物体的修饰蛋白进行鉴定并相对定量，从而达到研究生物体内修饰蛋白质组动态变化与集体表型改变之间关系的目的。

图1 蛋白磷酸化修饰iTRAQ定量技术路线

 

     （2）蛋白磷酸化修饰4D-DIA非标记定量
基于DIA全景扫描的无偏模式，DIA磷酸化蛋白质组得以突破传统DDA的限制，能够有效解决磷酸化修饰定性定量的难题，推进磷酸化分析向更高鉴定深度、更高定量重复性和定量准确性的方向发展。4D技术在原有保留时间、质荷比和离子强度的基础上，增加了离子淌度（CCS），在检测过程中能够进一步降低待测样本的复杂程度，显著提高了对蛋白修饰的检测能力，4D技术加持下的DIA磷酸化蛋白组技术，实现了对磷酸化蛋白的超高深度鉴定和超精准定量。

图2 蛋白磷酸化修饰4D-DIA定量技术路线

     （3）蛋白磷酸化修饰PRM靶向定量分析

       PRM（parallel reaction monitoring），平行反应监测技术，通过串联质谱，有目的地筛选目标蛋白肽段进行定量的靶向蛋白质组研究策略之一。PRM和MRM（multiple reaction monitoring，或SRM，selected reaction monitoring）技术类似，都可作为目标蛋白定量研究策略，需要先通过一级质谱将目标蛋白的肽段筛选出来；不同的是，在二级质谱时，PRM会将目标肽段所有碎裂的子离子信号进行采集，而MRM只采集筛选到的特定子离子信号，通过液质联用（LC-MS/MS）的方式，主要对感兴趣的磷酸化修饰蛋白进行定量验证。

图3 蛋白磷酸化修饰PRM靶向定量技术路线

  

信息分析内容（以4D-DIA磷酸化为例）

信息分析条款	信息分析内容
标准信息分析	1 项目概述及质控分析 1.1项目概述 1.2数据质控 1.3鉴定与定量细节表 2 DDA谱图库 3 磷酸化蛋白组鉴定 3.1磷酸化蛋白组鉴定结果统计 3.2磷酸化蛋白质组鉴定的质量评估 3.3磷酸化位点统计 4 磷酸化蛋白组定量 4.1差异定量分析 4.2主成分分析 4.3聚类分析 4.4时间序列分析 5 磷酸化蛋白组功能注释 5.1磷酸化蛋白质GO注释 5.2磷酸化蛋白质KOG注释 5.3磷酸化蛋白质Pathway代谢通路注释 6 差异磷酸化肽段对应蛋白的功能注释 6.1 GO富集分析 6.2 Pathway富集分析 6.3 KOG注释 6.4差异磷酸化肽段对应蛋白互作分析 6.5差异磷酸化肽段对应蛋白的亚细胞定位 7 磷酸化肽段Motif分析
定制化信息分析	可结合客户的需求，协商确定定制化信息分析服务内容。

 

华大科技于2012年完成整合，致力于成为全球生命科学研究机构的首选科技服务商，为从事生命科学研究的机构和企业提供高质量、行业领先的基因测序、质谱、合成生物学、生物数据库、云计算等标准化的技术服务和综合的全流程解决方案。 目前，公司服务已经覆盖了全球100多个国家和地区，拥有7,000多位合作单位，为25,000多位行业联系人提供了杰出技术支撑与服务，更通过深度合作完成了一系列大型基因组科研计划和国际多边合作项目。科研积累上，截至2020年9月底，公司累计参与发表近1,500篇文章，其中CNNS 120+。截止2022年3月，华大自主测序平台DNBSEQTM 助力发表2,013+篇高质量文章，影响因子合计8,800+，并实现CNS三大主刊发文。