人视网膜色素上皮细胞的培养与鉴定及相关研究！

                                   人视网膜色素上皮细胞的培养与鉴定及相关研究！
 

一、背景及概述
 
上皮细胞覆盖于身体表面并衬贴于体内空腔器官腔面的细胞。其排列有明显极性，一面朝向身体表面或腔面，称游离面；一面向着深部的结缔组织，称基底面。上皮细胞具有强大的角生和更新能力。上皮组织具有保护、吸收、分泌和排泄等作用。当上皮细胞受损时，则影响机体的防御功能。
 
人视网膜色素上皮细胞分离自视网膜组织；视网膜色素上皮（RPE）位于脉络膜和光感受器细胞外节之间，是视网膜下腔和脉络膜血管之间的离子、水、营养物质和代谢终产物转运通道；主要是由单层色素上皮细胞所构成，排列十分规则。人视网膜色素上皮参与视黄醇循环，吞噬脱落的光感受器细胞外节以维持光感受器细胞兴奋性，并分泌多种生长因子，帮助维持脉络膜血管内皮细胞和光感受器细胞的结构完整性。细胞呈多角形，细胞分为三部分，即顶部、体部和基底部。
 
人视网膜色素上皮细胞无再生能力，细胞死亡后不被替换，而是邻近的细胞向侧面滑动，以填补死亡细胞遗留下来的空间。人视网膜色素上皮位于脉络膜和光感受器细胞外节之间，是视网膜下腔和脉络膜血管之间的离子、水、营养物质和代谢终产物转运通道。人视网膜色素上皮参与视黄醇循环，吞噬脱落的光感受器细胞外节以维持光感受器细胞兴奋性，并分泌多种生长因子，帮助维持脉络膜血管内皮细胞和光感受器细胞的结构完整性。
 
二、冻存和复苏
 
根据慢冻速融的细胞冻存原则，将原代或传代1-2次培养的人视网膜色素上皮细胞，加入10％二甲基亚砜作为保护剂，液氮中冻存。复苏时将冻存细胞在60℃、2分钟内融化，用台盼蓝染色测定细胞存活率，用抗人角蛋白抗体免疫细胞化学染色作细胞鉴定，每日计算细胞数以确定细胞生长曲线。结果显示经冻存复苏后的人视网膜色素上皮细胞的存活率达90％，生长状态与对照组无差异，抗人角蛋白染色阳性，细胞对数生长期在1-4天，群体细胞倍增期约为1.55天。因此人视网膜色素上皮细胞液氮冻存可保持生物活性，复苏后生长良好，保持了细胞特征。这可提供细胞系，方便了体外实验，并可能作为人视网膜色素上皮细胞移植治疗一些眼底病的细胞库。
 
三、培养和鉴定
 
有研究进行人视网膜色素上皮细胞的体外培养，为研究其生理功能、生化特征和病理过程提供细胞模型。
 
1、方法：用改良的眼杯缝线固定法，将其固定在眼球托上，通过消化获取人人视网膜色素上皮细胞，作细胞形态学、组织化学和电镜鉴定。
 
2、结果：人视网膜色素上皮细胞培养早期生长活跃、胞核透明、胞浆含丰富黑色素颗粒，Ｇｉｅｍｓａ染色见染色体，ＤＯＰＡ氧化酶呈阳性反应，透射电镜见细胞微绒毛及紧密连接。、人视网膜色素上皮细胞经体外培养及短期传代后，仍具有与体内细胞相似形态特征。可为人视网膜色素上皮细胞的深入研究提供丰富的实验研究材料。
 
四、相关研究
 
有实验研究可见光照对培养的人视网膜色素上皮(retinalpigmentepithelium，RPE)细胞凋亡的影响。以白色荧光灯为光源，用500lx、(2000±500)lx及(3400±200)lx不同光照强度，按不同的光照时间(无光照、6、12、24h)照射培养的人RPE细胞。利用终末脱氧核糖核苷酸转移酶介导的原位缺口末端标记(TUNEL)、荧光素标记的连接素V/碘化丙锭(AnnexinV-FITC/PI)双染色流式细胞测定、相差倒置显微镜等手段观察RPE细胞凋亡(分为光照后6、12、24、36h组)。结果可观察到RPE细胞出现两种死亡形式，凋亡与坏死。
(1)低于一定阈值(500lx)的光照对细胞损伤较轻，细胞凋亡及坏死随光照强度的增加而增加。
(2)在较短的光照时间(6h和12h)内，细胞死亡的增加以凋亡为主；随着光照时间的延长，细胞坏死逐渐明显。
(3)随着光照后培养时间的延长，细胞凋亡明显增加(P0.05)。光照后6、12、24h的损伤改变以凋亡为主，但随时间的延长，凋亡继发性坏死的增加显著。光照后36h，细胞的坏死数显著增高。　
 
此外，有研究探讨天冬酰胺特异酶切的半胱氨酸蛋白酶(caspase)成员caspase-3在柔红霉素诱导的人视网膜色素上皮(RPE)细胞凋亡中的变化。方法：原代培养的人RPE细胞经200μg·L-1柔红霉素诱导8，24和36h后，按照caspase-3荧光检测试剂盒说明处理细胞，再通过荧光比色法间接检测细胞碎片中caspase-3的活性。结果正常caspase-3的活性为(0.094±0.005)nmolAFC，8h后增加为(0.446±0.029)nmolAFC，24h后为(0.754±0.056)nmolAFC，36h又下降到(0.486±0.033)nmolAFC，但都高于正常水平。加入特异性四肽抑制物DEVD-CHO1μL后活性为(0.040±0.003)nmolAFC，显著低于正常。因此Caspase-3参与了柔红霉素诱导的人视网膜色素上皮细胞的凋亡，柔红霉素可使其活性增加。
 
另外，有研究探讨蓝光光照对体外培养的人视网膜色素上皮(RPE)细胞凋亡及对线粒体膜通透性转运功能的影响。方法用蓝光光照体外培养的人RPE细胞。实验分为三部分。第一部分：不同光照度，分为3组，第1组光照度(500±100)lx，第2组光照度(2000±500)lx，第3组光照度(3000±500)lx；光照RPE细胞时间6h，光照结束后24h终止培养。第二部分：同一光照度、不同光照时间，检测RPE细胞亚型时分为3组，第1组光照时间6h，第2组光照时间12h，第3组光照时间24h，光照度均为(2000±500)lx；检测线粒体膜电位时也分为3组，第1组光照时间3h，第2组光照时间6h，第3组光照时间12h。
 
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