成骨、成软骨和破骨

 

简介

 

      成骨细胞是骨形成的主要功能细胞，负责骨基质的合成、分泌和矿化。骨不断地进行着重建，骨重建过程包括破骨细胞贴附在旧骨区域，分泌酸性物质溶解矿物质，分泌蛋白酶消化骨基质，形成骨吸收陷窝；其后，成骨细胞移行至被吸收部位，分泌骨基质，骨基质矿化而形成新骨。破骨与成骨过程的平衡是维持正常骨量的关键。成骨细胞起源于多能的基质的间质细胞，除成骨细胞外，基质细胞还可分化成软骨细胞，成纤维细胞，脂肪细胞或肌细胞。

 

      软骨细胞（chondrocyte）:位于软骨陷窝内。幼稚的软骨细胞位于软骨组织的表层，单个分布，体积较小，呈椭圆形，长轴与软骨表面平行，越向深层的软骨细胞体积之间增大呈圆形，细胞核圆形或卵圆形，染色浅，细胞质弱嗜碱性，常见数量不一的脂滴。成熟的软骨细胞多2~8个成群分布于软骨陷窝内，这些软骨细胞由同一个母细胞分裂增殖而成，称为同源细胞群。电镜下，软骨细胞有突起和皱褶，细胞质内有大量的粗面内质网和发达的高尔基复合体及少量的线粒体。在组织切片中，软骨细胞收缩为不规则形，在软骨囊和细胞之间出现较大的腔隙。

 

      破骨细胞(osteoclast，亦称bone-resorbing cells)是骨细胞的一种，行使骨吸收（bone resorption）的功能。破骨细胞与成骨细胞（osteoblast，亦称bone-forming cells）在功能上相对应。二者协同，在骨骼的发育和形成过程中发挥重要作用。高表达的抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase)和组织蛋白酶K（cathepsin K)是破骨细胞主要标志。

 

 

汉恒生物研究实例

 

C3H10T1/2成骨&成软骨分化报告

 

1、 C3H10T1/2细胞的培养，传代，冻存与复苏

 

C3H10T1/2细胞的形态：

 

 

 

2、成骨分化实验

 

方法：

2.1 成骨分化诱导培养

2.2 碱性磷酸酶（ALP）定量

2.3 茜素红染色

2.4 Q-PCR检测成骨分化指标

2.5 Western blotting法检测相关成骨marker的表达

 

结果：

1. 成骨诱导培养，各时间点细胞状态：

 

 

2. 成骨诱导培养第7天，ALP染色：

 

 

3. 成骨诱导培养第7天，ALP定量：

 

 

4. 成骨诱导培养各时间点，茜素红染色：

 

 

5. 成骨诱导培养，各时间点Q-PCR法检测相关成骨marker的表达：

 

 

6. 成骨诱导培养，各时间点Western blotting法检测相关成骨marker的表达：

 

 

 

 

3. 成软骨分化实验

 

方法和步骤：

3.1 成软骨分化诱导培养 (micromass 法)

3.2 阿辛蓝染色

3.3 Q-PCR检测各时间点成软骨分化指标

3.4 Western blotting法检测各时间点成软骨分化指标

3.5 免疫组化检测成软骨培养各时间点II型胶原的表达

 

结果：

1. Micromass法，成软骨诱导培养各时间点软骨团块形态：

 

 

2. Micromass法，成软骨诱导培养，各时间点阿辛蓝染色：

 

 

3. Micromass法，成软骨诱导培养， Q-PCR法检测各时间点相关软骨marker的表达：

 

4. Micromass法，成软骨诱导培养， Western blotting法检测各时间点相关软骨marker的表达：

 

 

5. Micromass法，成软骨诱导培养，各时间点免疫组化法检测II型胶原的表达：

 

 

 

 

SQSTM特定位点突变对破骨细胞分化的影响实验报告

 

     RAW264.7细胞是一种鼠源的巨噬细胞系，RAW264.7细胞贴壁快，形态以类圆形和不规则为主，一般1～2个核，极少数有3个核，胞浆伸展时胞体较大。细胞贴壁紧，胰酶-EDTA难以消化，需要多次消化吹打，也可采用细胞刮法。

    在RANKL的诱导下，RAW264.7细胞可以分化为成熟的破骨细胞，此时应用破骨细胞特异性的抗酒石酸酸性磷酸染色（TRAP染色），在有成熟破骨细胞的部位可见红色的阳性反应，所以一般认为RAW264.7是一种前成破骨细胞。 

    RAW264.7细胞向破骨细胞的分化是一个NF-kb通路依赖的过程，先前的大量研究表明，NF-kb通路受到抑制时，RAW264.7细胞不能向破骨细胞的分化。

    目前一般认为Sequestosome 1/p62 (p62，即SQSTM蛋白基因)基因的产物可以抑制NF-kb通路的活性，当Sequestosome 1/p62 (p62，即SQSTM蛋白基因)基因发生突变时，NF-kb通路的活性变强。

 

实验结果图：