LncRNA实时定量PCR技术服务

  LncRNA实时定量PCR技术服务

    LncRNA是目前生命科学以及医学研究领域中的研究热点之一。由于LncRNA具有一些重要的分子特征，在进行实时定量PCR检测的时候需要更为精细的实验设计:

    可变剪接：大部分的LncRNA在成熟过程中，经过剪接步骤。一些LncRNA在这个过程中形成剪接异构体，这些异构体的表达具有组织特异性，其中部分具有不同甚至相反的生物学功能，因此需要对LncRNA进行转录本特异的检测。

    长链反义非编码RNA（long antisense ncRNA）：大约50%的蛋白编码基因的基因组区域能够转录形成长链反义非编码RNA. 这些RNA分子转录方向和蛋白编码基因相反，没有蛋白编码能力，是LncRNA的重要组成部分。 sense转录本和antisense转录本可能具有不同的生物学功能，然而基于oligo（dT）或随机引物的标准RT-PCR方法缺乏链特异性，不能将两种转录本进行有效区分，得到的数值是两个转录本的总表达量。如图所示：经过第一轮PCR 反应后，sense转录本和antisense转录本产生相同的双链DNA产物,下游的PCR 反应无法进行区分。

*图释：  应用oligo (dT) 和随机引物的RT-PCR反应不具有链特异性

康成实例-1--- LncRNA qPCR 
    Dlx-5/6超保守区域转录形成两个剪接异构体LncRNA: Evf-1和Evf-2. Evf-2能够和Dlx-2蛋白结合形成稳定的复合物，进而刺激Dlx-5和Dlx-6的表达；而Evf-1功能未知。为了精确检测这两个LncRNA，我们在可变剪接位点设计了转录本特异的引物。如图2所示。

*图释：Evf-1和Evf-2的引物设计。绿色箭头代表的引物针对Evf-1设计，紫色箭头代表的引物针对Evf-2设计，红色的引物位于两个转录本共有的部分是非特异性引物所以不被选用。

康成实例-2--- LncRNA qPCR

    BACE1是是阿兹海默症病理学中的关键酶，催化Aβ蛋白形成，在阿兹海默病人的样品中表达量上升。BACE1基因DNA反义链上转录形成LncRNA  BACE1-AS. 细胞和活体实验证明 BACE1-AS具有调控BACE-1 mRNA稳定性的功能，因此能促进BACE-1蛋白的表达。准确检测BACE1-AS的表达量，是研究该LncRNA分子功能的关键。链特异性地RT反应，仅将靶标转录本（BACE1-AS）反转录成cDNA, 排除了反义链转录本带来的干扰。

*图释： 在RT步骤中选用链特异性地引物，仅检测BACE1-AS。

康成生物LncRNA实时定量PCR技术服务流程：

1. 引物设计、合成及测试

    a. 从权威数据库（Refseq, UCSC known gene, ensemble, 相关文献）中得到非编码RNA的序列，屏蔽SNP及重复序列。

    b. 在引物设计软件中，调整引物的设计位点，将引物设计在转录本特异的区域，如： exon-exon的连接点附近。然后根据PCR的反应条件，优化引物参数，如 Tm值，产物大小，二级结构，引物二聚体等。

    c.  通过和数据库blast比对，降低引物非特异性扩展的可能性。

    d. 通过实验对引物的扩增效果进行测试。

2. 样品RNA抽提及RNA质量检测
    a． 紫外吸收测定法测定RNA在波长260nm和280nm的吸收值，获得RNA的浓度并通过 A260/280及A260/230的吸收比值判断RNA的纯度。
    b． 甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA纯度和完整性。

3. 逆转录合成cDNA
    利用链特异性的反转录引物进行RT反应，合成cDNA。

4. 实时定量PCR
    以合成的cDNA作为模板进行实时定量PCR扩增。同时检测每个样品中内参基因的表达量，校正上样误差。

5. 分析结果、提供实验报告
    分析实时定量PCR结果，提供实验报告，包括详细的实验方法，实时定量PCR实验数据和图表。

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