microRNA螢光定量PCR(Real Time-PCR)

Step1

A.RNA抽提： SLNco高纯度总RNA或micoRNA抽取试剂盒

RNA质量检测：
（1）测定RNA在260nm和280nm波长处的吸收值，以计算其浓度并评估纯度。
（2）变性琼脂糖凝胶电泳，检测RNA纯度及完整性。

RNA提取项目

Step2

B.茎环结构引物或多聚T引物设计和合成

引物合成项目

Step3

C.逆转录：使用逆转录酶（AMV）将样品microRNA逆转录为cDNA。

RT-PCR项目

D.标准曲线制备：将标准品质粒做梯度稀释后，进行real-time PCR扩增和检测，以Ct值对拷贝数绘制标准曲线。

E.定量PCR反应：将待测样品加入优化过的real- timePCR反应液中，进行扩增，检测目的基因和内参基因的Ct值。每反应均做3个平行复孔。

F.数据分析：
（1）相对定量：使用△△Ct法计算目的基因在不同组间的表达差异。
（2）绝对定量：将样品的Ct值代入标准曲线，以对目的基因进行定量。
（3）熔解曲线分析：确定产物特异性。