1、SMART-seq
2012 年，由美国和瑞典的科学家共同开发了称为 Smart-Seq（Switching mechanism at 5’end of the RNA transcript）的技术 [1]。在 2013 年，Nature Methods 杂志上报告了新的方案，被称为 Smart-Seq2[2]，随后在 2014 年他们有公布了详细的操作流程 [3]。获取单细胞并裂解细胞后，含有 oligo-dT 的引物与 mRNA 的 poly- A 结合，逆转录酶 MMLV 进行逆转录，逆转录酶到达 mRNA 5’末端时，MMLV 的末端转移酶活性会在一链 cDNA 的 3'末端增加额外的胞嘧啶，这时 TSO 引物 3' 末端的 rGrG+ G 结合到首链末端的胞嘧啶，然后以首链 cDNA 为模版进行延伸合成互补的第二链，全长 cDNA 经过 PCR 扩增后进一步进行测序文库的构建。
▲SMART-seq2 技术原理
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1、起始量低：1 个细胞起始，适用于难以满足 10X Genomics 等平台起始细胞量要求的样本。
2、覆盖度高： 测序覆盖 cDNA 的全长序列，每个细胞能够获得上万个基因的表达。
3、信息个性化： 除了获得基因表达信息，数据能够用于可变剪接，cSNP 等分析，以及带 poly- A 结构的 lncRNA 研究。
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文库结构
图 SMART-seq2 文库示意图
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建议测序深度及参数
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指标 |
参数 |
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测序深度 |
6Gb/cell |
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测序类型 |
PE150 |
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1、类型：新鲜组织，原代细胞，细胞系等。
2、来源：血液提取、磁珠富集、流式富集、组织解离等。
3、样本量：单个细胞（或微量细胞）。
4、保存运输：细胞放入 SMART-seq 试剂盒指定的裂解液中，-80°C 保存，干冰运输。
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2、10X Genomics
10X Genomics 公司的 Chromium 系统利用 8 通道的微流体“双十字”交叉系统，将含 barcode 的凝胶珠（Gel Beads）、细胞和酶的混合物、油三者混合，形成 GEMs（油包水的微体系）。GEMs 形成后，细胞裂解，凝胶珠自动溶解释放大量 barcode 序列，随后 mRNA 逆转录产生带有 10X barcode 和 UMI 信息的 cDNA，构建标准测序文库，其中 10X barcode 用于区分细胞，UMI 用于区分 mRNA 分子。
图 10X genomics 技术原理
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1、通量高： 一张芯片具有 8 个独立的通道，可供 8 个样本同时上机，每个通道可捕获 10000 个细胞。
2、捕获率高： 单细胞捕获效率高达 65%，多细胞比例 <0.9%（1,000 个细胞中）。
3、延展性强： 除了获得单细胞 mRNA 的信息，还提供了单细胞 TCR/BCR、单细胞表面蛋白、单细胞 ATAC 等多种解决方案。
文库结构
图 10X Genomics 3’gene expression 文库示意图
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建议测序深度及参数
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指标 |
参数 |
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测序深度 |
50,000~100,000 reads/cell |
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测序类型 |
PE150 |
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1、类型：新鲜组织，原代细胞，细胞系等。
2、来源：血液提取、磁珠富集、流式富集、组织解离等。
3、样本量及其它质控要求：
| 样本类型 | 样本质控要求 |
| 细胞悬液 | >105 目标细胞个数（底限 10,000 个细胞）； |
| 活率 >80%； | |
| 浓度 500-1,000 个细胞 /ul； | |
| 细胞间无粘连（成团率 <5%）； | |
| 无大于 40μm 的细胞碎片或其他颗粒物； | |
| 不存在逆转录抑制剂和非细胞的核酸分子。 | |
| 血液 | EDTA 抗凝的全血（不可肝素抗凝），>5ml。 |
| 组织 | 0.3cm×0.3cm（不超过 0.5cm×0.5cm）的新鲜组织，4～5 块。 |
4、保存运输：
（1）细胞悬液：建议现场制备，如要运输，建议使用伯豪生物自主研发的单细胞保护液，4°C 运输，48 小时内送达伯豪生物实验室。
（2）血液：EDTA 抗凝的全血，4°C 运输，2 小时内送达伯豪生物实验室；或提取 PBMC 后冻存，干冰运输。
（3）组织：建议使用伯豪生物自主研发的单细胞组织保护液，4°C 运输，48 小时内送达伯豪生物实验室。
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3、BD Rhapsody
BD Rhapsody 技术利用卡式芯片在磁性的寡核苷酸条形码标记微球上实现单细胞捕获和 mRNA 转录本的分子标签，然后将这些微球合并到单个管中用于 cDNA 扩增和文库构建。可满足 100~10000 个细胞的自动分选、扩增及建库。
图 BD Rhapsody 技术原理
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此外，该技术使用带有寡核苷酸的高质量抗体（Ab-oligos），这条寡核苷酸带有抗体特异的条形码，细胞在经过 Ab-oligos 标记后，可在单细胞水平同时获得转录组和蛋白表达。
图 单细胞 mRNA 与蛋白同时测序
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| 高 效 | 每个样本可测 100~10000 个细胞； |
| 2 天内完成细胞悬液制备、单细胞捕获、扩增以及建库。 | |
| 灵 活 | 抗体标签技术可实现多样本混合捕获； |
| 可选择全转录组测序或目标基因测序。 | |
| 可靠 | 利用成像系统对单细胞捕获过程进行质控； |
| 单细胞捕获效率高达 80%，多细胞比例 <1%（1,000 个细胞中）。 | |
| 整合 | 可同时检测单个细胞的 mRNA 水平与蛋白水平。 |
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文库结构
图 BD Rhapsody 基因表达文库示意图
建议测序深度及参数
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指标 |
参数 |
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测序深度 |
50,000~100,000 reads/cell |
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测序类型 |
PE150 |
1、类型：新鲜组织，原代细胞，细胞系等。
2、来源：血液提取、磁珠富集、流式富集、组织解离等。
3、样本量及其它质控要求：
| 样本类型 | 样本质控要求 |
| 细胞悬液 | > 10* 目标细胞个数（底限 10,000 个细胞）； |
| 活率 >80%； | |
| 浓度 500-1,000 个细胞 /ul； | |
| 细胞间无粘连（成团率 <5%）； | |
| 无大于 40um 的细胞碎片或其他颗粒物； | |
| 不存在逆转录抑制剂和非细胞的核酸分子。 | |
| 血液 | EDTA 抗凝的全血（不可肝素抗凝），>5ml。 |
| 组织 | 0.3cm×0.3cm（不超过 0.5cm×0.5cm）的新鲜组织，4~5 块。 |
4、保存运输：
（1）细胞悬液：建议现场制备，如要运输，建议使用伯豪生物自主研发的单细胞保护液，4°C 运输，48 小时内送达伯豪生物实验室。
（2）血液：EDTA 抗凝的全血，4°C 运输，2 小时内送达伯豪生物实验室；或提取 PBMC 后冻存，干冰运输。
（3）组织：建议使用伯豪生物自主研发的单细胞组织保护液，4°C 运输，48 小时内送达伯豪生物实验室。
图 数据质控及过滤
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图 去除批次效应
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图 单细胞 RNA 测序细胞亚群注释
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图 单细胞 RNA 测序样本间的细胞构成差异
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图 单细胞 RNA 测序 Marker 基因分析
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图 单细胞 RNA 测序拟时序分析
图 单细胞 RNA 测序拟时序 GO 注释
图 单细胞 RNA 测序拟时序分化转录因子调控网络
图 单细胞 RNA 测序细胞亚群的功能富集分析
图 单细胞 RNA 测序细胞亚群的功能富集在样本间的差异
图 单细胞 RNA 测序样本间的功能差异分析
图 细胞通讯网络
1、胚胎发育
2、器官发育
3、干细胞分化
4、神经科学
5、肿瘤微环境
6、用药指导
7、病毒感染
伯豪生物客户项目发文
| 序号 | 伯豪生物提供服务 | 杂志 | IF | 发表年份 | 研究内容 |
| 1 | 【服务】RNA-seq 【样本】细胞 【原文链接】点击查看 |
Molecular Cancer | 27.7 | 2024年 | 疾病机制 |
| 2 | 【服务】RNA-seq 【样本】颅骨组织 【原文链接】点击查看 |
MATERIALS & DESIGN | 7.6 | 2024年 | 疾病机制 |
| 3 | 【服务】RNA-seq 【样本】海水 【原文链接】点击查看 |
Journal of Environmental Chemical Engineering | 7.4 | 2024年 | 环境 |
| 4 |
【服务】RNA-seq |
National Science Review | 16.3 | 2024年 | 基础医学 |
