转染小鼠单核巨噬细胞J774A.1专用转染试剂方法-

 转染小鼠单核巨噬细胞J774A.1专用转染试剂方法-上海转染生物科技有限公司
原标题：转染小鼠单核巨噬细胞J774A.1专用转染试剂方法-上海转染生物科技有限公司
ZetaLife Advanced DNA RNA Transfection Reagent
储存条件
4℃保存，拒绝反复冻融。
材料准备
1.siRNA、miRNA或者小分子浓度20 uM /L。
2.质粒DNA 浓度300 ng-2 ug/ul（注意：①溶解于无菌双蒸水或超纯水；②无内毒素 ），推荐500ng/ul左右。
操作步骤
1.提前1天接种细胞：细胞汇合度在60-80%左右（根据不同细胞生长速度需调整起始密度），再进行转染。
2. 核酸复合物制备：将核酸与转染试剂按照1:1关系直接混合，用移液器吹吸10-15次混匀，室温静止10-15分钟。
3.在细胞培养基中加入核酸复合物：根据参考用量在细胞中加入核酸复合物，并轻轻混匀；细胞培养基里面可以含有血清。
4.细胞换液：转染24小时后对细胞进行正常换液，悬浮细胞转染过程中不用换液。
5.分析结果：质粒DNA转染48-72小时后荧光检测转染效率，48-96小时检测mRNA或蛋白表达。若进行稳定表达细胞株的筛选，则在转染后24-48小时左右加入适量的药物进行筛选。siRNA转染后9小时荧光检测转染效率，48-72小时检测mRNA或蛋白表达。
注意事项
 1、质粒DNA必须溶解于无菌双蒸水或超纯水，但不能溶解于提取试剂盒提供的Buffer。溶解于Buffer的质粒转染效率会下降80%左右，甚至会转染失败。
 2、质粒必须去除内毒素，内毒素对细胞将产生很大的细胞毒性，会导致转染效率下降70%-80%左右，甚至导致转染失败（推荐使用Qiagen、TIANGEN、Omega去内毒素质粒提取试剂盒）。
 3、复合物的制备过程中是绝对不能用其他任何试剂对核酸或转染试剂进行稀释，只需将核酸和转染试剂两者按1:1比例直接混合，如果进行了稀释会导致转染失。
4、转染试剂与核酸混匀后用移液器吹打10-15次，室温孵育10-15分钟后即可加入细胞培养板。
 5、转染24小时后进行正常换液，不能像Lipo2000一样转染4-6小时后换液。
 6、原代细胞、免疫细胞转染时，细胞基础培养基里面不能含有双抗培养基。
 

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