荧光原位杂交（FISH）技术服务

是一种简单、敏感、而容易操作的方法，结果迅速，并能在同一标本上检测多个不同的基因，可应用于细胞培养、染色体分裂像、冰冻切片和石蜡切片。
FISH荧光原位杂交技术是利用特异的DNA探针，标记了生物素，、或荧光素，对检测细胞进行DNA-DNA原位杂交，并用荧光法显示。
FISH荧光原位杂交技术步骤
试剂配制：
（1）变性液（70%甲酰胺 + 2×SSC，pH7.0）：4 ml 20×SSC；8 ml 蒸馏水；28 ml 甲酰胺。每次新鲜配制。
（2）杂交后洗涤液： 20×SSC 4 ml；蒸馏水16 ml；甲酰胺20 ml。每次新鲜配制。调节pH前升至室温。
 1.  用硅化玻片，石蜡切片，60℃烤片过夜。二甲苯脱蜡至酒精，斜置切片，空气中干燥。
2.  蛋白酶处理：
（1）每个染色缸40 ml 蛋白酶K消化溶液，配制方法如下：2×SSC 40 ml 倒入Facal管，在水浴槽中预热。将消化酶液加入管内，摇动直到酶溶解。
（2） 37℃水浴槽中预热染色缸和蛋白酶K溶液。37℃孵育20 min。
（3） 2×SSC在室温下漂洗切片3次，每次1 min。
（4）梯度酒精脱水（-20℃预冷），空气中干燥。
3.  变性：
（1）每一个立式染色缸配制40 ml 变性溶液；
（2）78℃水浴槽中平衡预热混合液染色缸；
（3）78℃孵育8 min；
（4） 即移入-20℃预冷70%酒精的染色缸内2 min，再依次移入80%、90%和100%的-20℃预冷酒精内，每缸2 min；
（5）空气干燥。
4.  杂交：
（1）准备探针；
（2）取一个较大的湿盒，交叉放置切片；
（3）滴10 μl 探针在切片的组织上，加盖玻片；
（4）盖上湿盒盖，37℃孵育12~16 h。
杂交后水洗：
（5）镊子小心去除盖玻片；
（6）43℃预热杂交后水洗溶液40 ml 水洗切片15 min；
（7）2×SSC（37℃）洗两次，每次10 min；
（8）切片放人染色缸的1×PBS内待检测，勿使切片干燥。
检测：
（9）从1×PBS中取出切片，除去过多的水分，避免标本干燥。把切片放入湿盒内，同时处理4张切片。
（10）每张切片使用30~60 μl 罗丹明抗-抗体或FITC卵白素，室温下孵育20 min；
（11）去掉塑料盖膜，把切片放入含1×PBS的染色缸。1×PBS室温下洗3次，每次2 min。
扩增：
（12）从1×PBS中取出切片，斜置切片使液体排出；
（13）每张切片滴30~60 μl 抗-卵白素抗体，加塑料盖膜，室温孵育20 min；
（14）去掉塑料盖膜，把切片放入含1×PBS的染色缸。1×PBS室温下洗3次，每次2 min；
（15）从1×PBS中取出切片，斜置切片使液体排出；
（16）每张切片滴30~60 μl 抗-卵白素抗体，加塑料盖膜，室温孵育20 min；
（17）1×PBS室温下洗3次，每次2 min。
5.  细胞核染色：
（1）张切片加10~20 μl DAPI，覆盖盖玻片并在室温下孵育2~5 ml；
（2）尽可能快的在荧光显微镜下观察或封闭盒内保存在-20℃冰箱。切片在染色之后1h内可以在显微镜下观察。
 二、FISH荧光原位杂交技术用引物介导的原位标记（PRINS）
是PCR和荧光原位杂交（FISH）的结合， PRINS是由未标记的序列特异性寡核苷酸探针与固定在细胞内的靶DNA互补序列，在聚合酶的驱动下，带有标记的脱氧核苷酸（FITC-dUTP或半抗原-dUTP）和dATP、dCTP、dGTP的延伸，依赖标记，新合成的DNA就能直接的或间接的带有FITC，用荧光显微镜观察。
FISH荧光原位杂交技术，PRINS实验步骤
1.  常规脱蜡浸入0.01 mol/L PBS；
2.  用0.2 mol/L 盐酸处理5min；
3.  蛋白酶K（25 μg/ml）消化37℃ 15 min；
4.  分别用80%，95%和100%酒精脱水，室温干片；
5.  加PCR混合液25 μL（10 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L KCl，1.5 mmol/L MgCl2，各加200 μmol/L dATP，dCTP，dGTP，1.5 mmol/L dig-11-dUTP 1.5 μl，引物250 ng，Taq DNA聚合酶2 U），加盖片；
6.  94℃变性5 min后置入65℃湿盒中5 min；
7.  用0.1×SSC液，65℃洗5 min；
8.  片于65℃ 10~20 s；用4×SSC-0.1%吐温20液42℃洗5 min，2次；
9.  经Buffer 1液洗后滴加20%羊血清封闭30 min；
10.  加抗体复合物（1：500）室温下2 h；
11.  BufferⅢ液洗5 min；
12.  用BCIP-NBT显色1~2 h，在镜下控制，终止显色；
13.  用中性红或核固红衬染，酒精脱水，二甲苯透明，树脂封片。
FISH原位杂交实验技术服务服务说明：
1. 请提供尽量多的实验材料；
2. 客户须在实验开始前确保其细胞或组织中有目的基因的表达，并提供目的基因的相关信息（基因名称、序列等信息）；
3. 客户应对所提供的材料及信息负责，如因客户提供的材料及信息不准确而引起的实验延误或经济损失由客户承担；
4. 实验所需的探针，可以由您自己提供，也可以委托本公司设计合成。如果由您自己提供，必须确保探针的质量，本公司不接受已溶解的探针。
FISH原位杂交实验技术服务服务承诺：
1. 会在最短的时间内快速将实验完成。
2. 保证检测结果准确、客观、可信，但不能确保一定要得到某特定结果。将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交 ，称为原位杂交。
FISH原位杂交实验技术服务服务流程：
1. 根据客户送的样本（固定好或者包埋好），以及样本类型，安排实验；
2. 包埋或者切片后，根据客户所测指标，设计特异性探针，标记示踪物。然后进行一系列反应；
3. （可选）根据上述所做好的切片进行拍片，分为荧光显微镜（激光共聚焦显微镜）或普通光学显微镜；
4. （可选）针对做好的玻片进行分析，分析时选取较好的区域，分析三个视野；
5. 提供实验报告：包括详细的实验方法及原位杂交实验结果的相关图表。
 

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