主要实验步骤如下:
1. 设计并合成Realtime PCR引物。
2. 引物溶解后使用TaqDNA聚合酶进行含SG(SYBR® Green)的PCR反应的优化。
3. 客户样品RNA抽提
4. RNA质量检测
5. 按照逆转录酶使用说明将样品RNA逆转录为cDNA。
6. 制备标准曲线样品:进行相对定量,需要先将样品的目的基因以及管家基因进行PCR扩增,其产物进行梯度稀释用于做标准曲线。
7. 标准曲线样品和待测样品分别加入到含SG的RealTime PCR反应液中,进行RealTime PCR扩增和检测。
8. 检测结果进行标准曲线分析,以对待测样品的目的基因进行定量。相对定量实验需要进一步用样品的目的基因测得值除以管家基因测得值以校正误差,所得结果代表某样品的目的基因相对含量。
9. 提供实验报告,包括详细的实验方法及实时荧光定量PCR实验结果及相关图表。
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