整体透明光片三维成像技术在骨与牙组织神经投射研究的应用

骨和牙组织一直以来都是医学和生物学研究的重点领域。从功能上看，它们承担着不可或缺的角色。骨骼为身体提供支撑框架，保障我们能够站立、行走和进行各种活动；牙齿则负责咀嚼食物，开启消化过程的第一步。长期以来，科学家们已经认识到感觉和交感神经元对骨和牙组织有着紧密的神经支配关系。例如，在疼痛感知方面，当我们的牙齿出现龋齿或骨骼受到损伤时，会产生疼痛信号，这背后就离不开神经的传导。在骨稳态的维持上，神经也发挥着微妙的调节作用，它们就像幕后的“指挥官”，协调着骨细胞的活动，确保骨骼的正常代谢和修复。

过往的研究主要依赖传统的组织学分析方法，也就是对薄切片进行研究。这种方法虽然在一定程度上为我们提供了有价值的数据，但存在着明显的局限性。当试图从多个薄切片重建三维图像时，由于在切片过程中重要结构信息的丢失或扭曲，我们很难全面、准确地观察和分析分散的神经元投射情况。而且，三维重建过程复杂、耗时，还容易因为切片间染色的差异和人为因素引入误差，就像拼图时部分拼图块缺失或错误，难以还原完整的图像。

随着科技的飞速发展，组织透明技术和光片三维成像技术应运而生，为这一研究领域带来了新的曙光。这些先进技术使得在完整组织中以细胞分辨率对神经元结构进行三维可视化研究成为可能。

研究方法精要
1、组织取材和脱钙
研究选取小鼠其股骨和下颌骨进行实验。首先是组织取材与固定，小鼠经麻醉后，通过左心室灌注特定溶液，取出股骨和下颌骨，仔细清理周围软组织，并在特定条件下进行固定。接着是关键的脱钙环节，在室温下进行30-40小时的脱钙处理，同时不断旋转样本，确保脱钙效果均匀。

2、组织脱色、染色和透明
脱钙完成后进行脱色、免疫染色等操作，其中免疫染色使用了抗体，每种抗体的稀释比例和孵育条件都经过了精心优化。最后进行组织透明化处理，通过一系列试剂的梯度浸泡和孵育，使组织达到透明状态，便于后续成像观察。

3、图像处理
在成像方面，综合运用立体显微镜和光片荧光显微镜，针对不同的样本和观察需求，选择合适的物镜和成像参数，确保能够获取高质量的图像。随后利用专业软件对图像进行处理和分析，包括图像预处理、拼接和三维可视化和神经元分割等操作，从而清晰地呈现神经末梢在骨和牙组织中的空间三维分布情况。

实验结果亮点
1、股骨神经纤维分布
在股骨的研究中，发现GP9.5标记的神经束有着独特的分布路径。它们通过股骨近端干骺端和远端骨骺的滋养孔进入骨髓腔，进入后像树枝一样广泛分支。在近端进入的神经束，一部分分支延伸到转子和股骨颈上方，另一部分则向下进入骨干骨髓腔，这些分支在骨干内常常平行排列，且延伸距离较长，但不会跨越生长板。在远端骨骺进入的神经束则终止于软骨下骨的骨髓腔。

神经纤维与血管的关系也十分密切。在骨髓腔中，常常可以观察到神经纤维沿着血管走行，其末端形态多样。有的呈经典的螺旋状围绕血管，有的则以游离末端的形式终止在血管附近或远离血管的地方。其中一些游离末端在其长度方向上存在膨体结构，而另一些则没有，并且多数游离末端呈球状。从股骨近端到远端，神经支配密度呈现逐渐降低的趋势，在骨干的下三分之一和远端干骺端密度最低。

CGRP标记的轴突同样经股骨近端颈部或远端骨骺的滋养孔进入骨髓腔，进入后沿着骨干平行向下延伸，标记不同之处在于纤维，它们没有螺旋状形态，而是在长度方向上有大量的膨体结构，且大多以游离末端的形式终止在骨髓腔或靠近骨内膜处。部分轴突还会沿着血管从骨髓腔进入皮质骨，或者从皮质骨进入骨髓腔。在骨干的下三分之一区域，偶尔会出现非常复杂的终止结构，通过对其进行细丝追踪发现，这些复杂结构的轴突长度可达约7659μm，具有102个分支点和65个末端。

TH标记的神经纤维在股骨中的分布也有其特点。与CGRP标记的感觉神经纤维不同，它在血管周围呈现明显的螺旋状形态，且只有较少的轴突分支终止在骨髓腔或骨内膜附近。在远端骨骺的软骨下骨区域，有大量的TH标记神经纤维和末端。这些神经纤维会穿过皮质骨的管道，跟随血管在骨髓腔和皮质骨之间穿梭。在骨干的下三分之一处，还能观察到TH标记神经纤维与血管之间复杂的分支关系，有时会出现单个轴突分支并环绕两三个相邻血管的情况，其末端紧密贴近血管。

2、下颌骨及牙髓神经纤维分布
对于下颌骨及牙髓的神经支配研究也有重要发现。PGP9.5标记的神经纤维支配下颌磨牙，它们从下牙槽神经发出，呈束状走行，在接近磨牙及其周围组织时逐渐分支变细。这些分支通过磨牙根的根尖孔进入牙髓，进入后向冠髓投射并广泛分支，形成密集的神经丛。此外，还有一束神经纤维通过牙根的副根管进入牙髓，这一发现为神经进入牙髓的途径提供了新的认识。在磨牙周围的组织中，如牙槽骨、牙周韧带和牙龈等部位，也有神经纤维的分布。一些小分支在牙槽骨中终止，部分分支进入牙周韧带和牙龈，其末端形态多样，包括游离末端和其他的复杂末端，并且在牙周韧带中形成围绕牙根的“篮子”状结构。

CGRP标记的神经纤维在牙髓及周围组织中广泛分布，同样通过根尖孔和副根管进入牙髓，在牙髓内形成极为密集的神经支配网络。在牙周韧带、下颌牙槽骨（包括骨髓）和牙龈等部位，也有大量的CGRP标记轴突分支，且大多以游离神经末端的形式终止。通过高分辨率成像可以清晰地分辨出这些轴突在牙周韧带中的终止结构，它们参与构成了围绕磨牙的“篮子”状结构，为牙周组织的神经支配提供了更详细的信息。

TH标记的神经纤维在牙髓中也有较多分布，同样通过根尖孔和副根管进入，但通过副根管进入的数量相对较少。在周围组织中，TH标记的神经纤维主要围绕血管分布，在牙周韧带、下颌牙槽骨和牙龈等部位的分布相对稀疏，只有少数轴突以游离末端的形式终止在血管外，且不参与牙周组织中“篮子”状结构的形成。

未来研究展望
这一创新技术通过独特的双焦点成像方案和深度学习分类网络,显著提升了大组织成像的速度和效率。在多种样本成像实验中，SIFT均表现出卓越的性能，无论是小鼠前爪、胃，还是斑马鱼幼虫、小鼠结肠和大脑等组织，SIFT都能以更快的速度获取高质量的图像。其在空间分辨率和时间分辨率方面的优势，使得研究人员能够更清晰地观察组织内部结构，更及时地捕捉动态变化。

SIFT对不同组织透明化方法适应性强，在生物医学成像领域应用潜力大。虽目前成像速度受相机等限制，但为ASLM技术发展提供重要思路。未来，靠改进相机、采用更快LFA或优化控制信号等，有望提升其性能，为生物医学研究开拓更多可能，助力探索生命奥秘、攻克疾病难题。

通过整体透明光片三维成像技术探究神经元亚群与骨、牙组织细胞之间的神经信号传导通路，是理解神经功能和结构的关键。整体透明光片三维成像技术结合基因编辑、蛋白质组学、空间组学和MERFISH等先进技术，我们能深入研究神经元与骨细胞、成牙本质细胞、血管内皮细胞等之间的分子机制，为我们理解疾病的发病机制提供新的视角，为早期诊断和治疗找到潜在的生物标志物和靶点。

声明：本文仅用作学术目的。文章来源于：Thai J, Fuller-Jackson JP, Ivanusic JJ. Using tissue clearing and light sheet fluorescence microscopy for the three-dimensional analysis of sensory and sympathetic nerve endings that innervate bone and dental tissue of mice. J Comp Neurol. 2024 Jan;532(1):e25582. doi: 10.1002/cne.25582.