PCR、qPCR和RT-PCR的特点、操作步骤及常见问题的原因

PCR 作为分子生物学的超级工具，有着多种变体。今天，我们就来深入聊聊各类 PCR 的区别及实验操作步骤，让你从此对 PCR 了如指掌！

01
各类 PCR ，分不清？

PCR (Polymerase Chain Reaction) 即聚合酶链式反应，是指在 DNA 聚合酶催化下，以母链 DNA 为模板，以特定引物为延伸起点，反应体系中加入 dNTP、Mg2+ 等原料，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板 DNA 互补的子链 DNA 的过程，可快速特异性地在体外扩增目的 DNA[1][2]。

知识链接

• Ct 值 (Cycle threshold，循环阈值)，是指 qPCR 反应中荧光信号达到设定阈值时对应的循环数 (一般 Ct 值在 20-30 之间)。

• 扩增曲线 (Amplification curve) 是指随 PCR 反应进行，根据荧光信号强度随着循环数变化而绘制的曲线。正常的扩增曲线 (S 型) 包括四个阶段：基线期、指数增长期、线性增长期、平台期。

• 熔解曲线 (Dissociation curve) 是指随温度升高 DNA 的双螺旋结构降解程度的曲线。

• 扩增子 (Amplicon) 为DNA或RNA扩增后的一段核苷酸序列。比如通过PCR扩增得到的某个基因的扩增片段。更简单地说，扩增子是经过人工扩增的DNA片段或RNA片段的扩增产物。

 
PCR 在基础科学研究 (如基因功能分析、基因检测)、医学诊断 (如病原体检测和遗传病筛查)、法医鉴定 (如身份鉴定) 以及环境监测 (如生物多样性研究) 等具有广泛的应用，是现在生物技术和遗传研究的核心工具。

 
当然，各类 PCR 实验除了在特点、应用、优缺等有诸多不同之外，其实验操作也是有区别滴~接下来就和小 M 一起来看下它们的操作步骤吧！ 

02
常规 PCR

PCR 的基本成分包括模板 DNA、引物、反应缓冲液、游离核苷酸、聚合酶、盐和水 (不含核酸酶和污染 DNA) 等。只要目标区域两侧的碱基序列 (寻找的特定 DNA 序列)是已知的，几乎任何 DNA 区域都可以作为 PCR 扩增的模板[10]。

在典型的 PCR 分析中，通过重复简单的三步过程：变性、退火和延伸，目标区域即可完成扩增 (图 1)。

图 1. PCR 反应流程图^[10]。

 
基本步骤：

(1) 准备反应体系：模板 DNA、引物 (正、反向)、dNTPs (dATP、dTTP、dCTP、dGTP)、PCR 反应缓冲液 (提供合适的 pH 和离子强度)、耐高温 Taq DNA 聚合酶、去离子水等。也可直接使用 PCR Mix。
(2) PCR 扩增：设置 PCR 扩增程序 (包含变性、退火、延伸、循环、彻底延伸)。
(3) 检测：通过琼脂糖凝胶电泳检测扩增效果。

03
实时荧光定量 PCR (qPCR)

实时荧光定量 PCR (Quantitative Real-time PCR, qPCR) 是 DNA 的实时 PCR 扩增，通过荧光探针测量，最常见的是插入染料或基于水解的探针，从而实现 PCR 产物的定量 (见图 2)。该技术常用于检测病原体的存在和确定感兴趣的 DNA 序列的拷贝数。

 
同样要经过多个扩增循环，其中模板 DNA 最初变性，然后是针对特定序列的寡核苷酸引物的退火，随后通过耐热 DNA 聚合酶从每个退火引物延伸互补链，导致扩增子数量在 PCR 期间呈指数增长，扩增子数量的增加是在 PCR 过程中通过荧光报告基因检测“实时”记录的。

基本步骤：

(1) 准备反应体系：模板 DNA 或经过逆转录得到的 cDNA、引物 (正、反向)、荧光染料 (如 SYBR Green) 或探针 (如 Taq man 探针、qPCR 探针等)、dNTPs   (dATP、dTTP、dCTP、dGTP)、PCR 反应缓冲液 (提供合适的 pH 和离子强度)、耐高温 Taq DNA 聚合酶或专用的荧光 PCR 聚合酶、去离子水等。也可直接使用 qPCR Kit。
(2) PCR 扩增：同常规 PCR，并设置荧光检测步骤。
(3) 荧光检测：通过荧光探针或染料实时监测荧光信号。
(4) 数据分析：根据 Ct 值和标准曲线，计算样本中的目标 DNA 或 RNA 浓度。

常用两种报告系统：插入式 SYBR Green 测定法和 TaqMan 探针系统。

01
SYBR Green 

• SYBR Green 通过插入相邻碱基对与所有双链 DNA 结合，发出荧光信号 (图 3A)。

• 在未结合状态下，SYBR Green 不发出荧光。因此，在每个周期中，通过荧光的相应增加来测量模板扩增。

02
TaqMans 探针

• 退火过程中，Taq Man 探针和引物与模板结合。当 Taq Man 探针完好无损时，能量在猝灭器和报告器之间传递，因此，没有检测到荧光信号。

• 当 Taq 聚合酶合成新链时，该酶的 5’ 外切酶活性会切割带有标记的探针上的 5’ 核苷酸，从而使报告分子从探针上释放出来。一旦它不再靠近，来自探针的荧光信号被检测到，并通过荧光的相应增加记录模板扩增 (图 3B)。

 
04
逆转录 PCR (RT-PCR)

逆转录 PCR (Reverse transcription PCR, RT-PCR) 可使用 RNA 作为模板生成互补 DNA (cDNA)。利用逆转录酶，产生 cDNA 的单链拷贝。然后，这可以通过 DNA 聚合酶扩增，产生双链 cDNA，进入基于 PCR 的标准扩增过程 (图 4A)。

该技术可用于目标基因 (GOIs) 的分子克隆，其可研究用抑制剂、兴奋剂、小干扰 RNA (siRNA) 或敲除模型等处理模型系统后基因表达的变化。这项技术也经常用于检测 RNA-Seq 实验之前 (作为质量控制) 和之后 (确认变化) 的表达变化。

基本步骤：

(1) 准备反应体系：提取 RNA，加入逆转录酶 (常用的逆转录酶有 M-MLV 逆转录酶和 AMV 逆转录酶)、引物 (通常使用随机引物，oligo (dT) 引物或基因特异性引物)、dNTPs (dATP、dTTP、dCTP、dGTP)、反转录缓冲液 (提供合适的 pH 和离子强度)、RNase 抑制剂 (防止 RNA 在反应过程中降解)、去离子水等。也可直接使用 RT-PCR Kit。
(2) 逆转录：设置逆转录程序。
(3) PCR 扩增：以合成的 cDNA 为模板进行 PCR 或 qPCR 实验。(RT-qPCR 分一步法 RT-qPCR 和两步法 RT-qPCR 两种)。
(4) 产物分析：通过琼脂糖凝胶电泳 (RT-PCR) 或荧光信号 (RT-qPCR) 分析扩增效果。

此外，一种将 RT-PCR 与 qPCR 相结合的技术，逆转录定量实时 PCR (Reverse transcription  quantitative real-time PCR, RT-qPCR)。通过在 qPCR 反应中使用 cDNA 来测量 RNA 水平，从而可以快速检测基因表达变化 (图 4B)。

图 4. RT-PCR 和 RT-qPCR 流程图^[11]。

注：RNA 质量至关重要！！！OD_260/280=1.9-2.1 的 RNA 才 "优秀" 。

此外，选择合适的内参 (或内标) 是非常重要的，这关系到实验结果的准确性和可靠性。小 M 为大家整理了qPCR 常用的内参基因参考，需要的小伙伴可关注收藏喔~ 
 

 
选择策略 Tips：根据实验样本类型进行预实验测试候选内参基因在目标样本中表达的稳定性确定合适的内参基因。

05
数字 PCR (dPCR)

数字 PCR (Digital PCR, dPCR) 是目前可用的另一种强大技术，在临床诊断中有着广泛的应用。其中，dPCR 方法用于液体活检中的癌症监测和器官移植排斥监测等应用，这两种方法都基于检测患者样本中低丰度的无细胞 DNA[13]。

dPCR 技术的原理 (图 5) 涉及将具有制备的 PCR 溶液的样本分离成大量分区 (通常为纳升大小的液滴)，其中单独进行 PCR 反应。每个分区包含零个、一个或几个目标 DNA 副本，遵循泊松分布 (Poisson distribution)。

在荧光探针存在下进行等位基因特异性 PCR 反应后，通过荧光检测含有扩增目标序列的分区。每个分区单独进行荧光扫描，根据目标 DNA 的副本是否存在，读数为“1”或“0”。阳性分区占总数的比例可以确定样本中目标序列的浓度。

基本步骤：

(1) 样本准备：模板 DNA 或通过逆转录反应得到的 cDNA，调整至合适浓度用于后续分配过程。
(2) 反应体系准备：模板 DNA 或 cDNA、引物 (正、反向)、荧光染料 (常用 SYBR Green) 或探针 (如 Taqman 探针、qPCR 探针等)、dNTPs (dATP、dTTP、dCTP、dGTP)、PCR 反应缓冲液 (提供合适的 pH 和离子强度)、耐高温 Taq DNA 聚合酶或专用的数字 PCR 聚合酶、去离子水等。
(3) 反应体系分配：将反应混合液分为多个微反应单元。
(4) PCR 扩增：设置 PCR 扩增程序，每个微反应单元独立进行 PCR 扩增反应 (包含变性、退火、延伸、循环、彻底延伸)。
(5) 数据分析：检测阳性反应单元数量并定量分析样本中目标 DNA 或 RNA 的浓度。
 
注意事项：

• 设置合适的阴性对照和阳性对照可确保实验结果的可靠性。
• 数字 PCR 一般需要比常规 PCR 更多的循环次数，因为在有的微反应单元中的模板可能经过几次循环之后才开始扩增反应。高次数循环反应能保证只要孔中有模板，每个 PCR 孔中都能产生几乎相等的 PCR 产物。 

06
小结

PCR 技术是分子生物学研究的利器，了解掌握各类 PCR 的特点、操作步骤及常见问题的原因，有助于提高实验成功率，为科研提供可靠数据支持。希望这篇整理对你有所帮助！如果有更多问题或经验分享，欢迎在评论区留言，我们一起探讨学习！ 

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HY-K0511A	RT Master Mix for qPCR Ⅱ (gDNA digester plus)
HY-K0510A	RT Master Mix for qPCR Ⅱ
HY-K0512	RT Master Mix for qPCR Ⅲ (poly A)

参考文献：
[1] Mullis KB, et al. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. Methods Enzymol. 1987;155:335-50.
[2] Saiki RK, et al. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science. 1985 Dec 20;230(4732):1350-4. 
[3] Garcia JG, et al. Polymerase chain reaction: a landmark in the history of gene technology. Crit Care Med. 2005 Dec;33(12 Suppl):S429-32.
[4] Taylor SC, et al. The Ultimate qPCR Experiment: Producing Publication Quality, Reproducible Data the First Time. Trends Biotechnol. 2019 Jul;37(7):761-774.
[5] Bustin S, et al. Talking the talk, but not walking the walk: RT-qPCR as a paradigm for the lack of reproducibility in molecular research. Eur J Clin Invest. 2017 Oct;47(10):756-774.
[6] Bustin SA. Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays. J Mol Endocrinol. 2000 Oct;25(2):169-93.
[7] Sanders R, et al. Improving the standardization of mRNA measurement by RT-qPCR. Biomol Detect Quantif. 2018 Mar 16;15:13-17.
[8] Coudray-Meunier C, et al. A comparative study of digital RT-PCR and RT-qPCR for quantification of Hepatitis A virus and Norovirus in lettuce and water samples. Int J Food Microbiol. 2015 May 18;201:17-26.
[9] Fraisse A, et al. Digital RT-PCR method for hepatitis A virus and norovirus quantification in soft berries. Int J Food Microbiol. 2017 Feb 21;243:36-45.
[10] Analytical Methods, et al. PCR - the polymerase chain reaction. Anal Methods. 2013 Dec 19;6(2):333-336.
[11] Grace Adams. A beginner’s guide to RT-PCR, qPCR and RT-qPCR. Biochem (Lond) 22 June 2020; 42 (3): 48–53.
[12] Smith CJ, et al. Advantages and limitations of quantitative PCR (Q-PCR)-based approaches in microbial ecology. FEMS Microbiol Ecol. 2009 Jan;67(1):6-20.
[13] Nogués N. Recent advances in non-invasive fetal HPA-1a typing. Transfus Apher Sci. 2020 Feb;59(1):102708.