β-葡聚糖（酵母和蘑菇）含量检测试剂盒使用说明书
产品介绍：
重要信息：
本检测程序已于 2023 年 8 月更新（检测程序 08/23），在检测试剂中增添了海藻糖酶悬浮液（7 号瓶）。在检测程序的第二部分（测定 α-葡聚糖）添加海藻糖酶可提高含海藻糖（α-D-吡喃葡糖基-（1,1）-α-D-葡萄糖苷）样品的 α-葡聚糖测量值。因此，计算出的 β-葡聚糖含量会下降。所有样品类型都应遵守更新后的检测程序。
（1-3）-β-葡聚糖广泛存在于自然界中，在藻类、真菌和酵母中尤为多见，也存在于高等植物中。β-葡聚糖具有多种生物学功能：是细胞壁的主要结构成分，可作为碳水化合物贮藏，在有些情况下，受到刺激（例如，创伤）的部位也可能合成 β-葡聚糖，以发挥保护作用 1。
中医在数百年前就已认识到许多蘑菇的药用功效，并将其入药。最近有研究1-7证明，蘑菇中的关键活性物质是三萜类化合物、麦角固醇，以及最重要的1,3:1,6-β-葡聚糖。这类 β-葡聚糖能够激活免疫系统，甚至可能具有抗癌功效 1-7。
监管机构对这类营养补充剂的健康声称以及相关产品的标识和纯度表示担忧 8，尤其令人担忧的药用菌产品。相关研究已确定药用菌的关键活性成分为1,3:1,6-β-葡聚糖、三萜类化合物和麦角固醇。
目前已有研究对多种蘑菇的 1,3:1,6-β-葡聚糖成分进行相当详细的研究，并确认其最主要的结构特征是以 1,3-β-葡聚糖为主链，以 1,6-β-葡聚糖为支链，且主链上的每 3 个 9 或 4 个 D-葡萄糖残基连接一条 1,6-β 支链。但也有研究报告了更为复杂的结构 10-14。蘑菇和真菌 β-葡聚糖与谷物 β-葡聚糖（所谓的混联 β-葡聚糖）的结构差异非常大。谷物 β-葡聚糖是线性多糖，其中 D-葡萄糖残基通过 1,3-β和 1,4-β 糖苷键连接，而且这两种连接键的比例因 β-葡聚糖的来源（例如，燕麦、大麦和小麦）而异。其他类型的 β-葡聚糖包括纤维素（1,4-β-D-葡聚糖）和凝胶多糖（1,3-β-D-葡聚糖）。已有研究说明用于测定谷物 1,3:1,6-β-葡聚糖的高度特异性酶法检测程序 15,16。纽勤提供基于这种方法的检测试剂盒：β-葡聚糖检测试剂盒（混联）（K-BGLU）。
商用酵母产品中描述了 1,3:1,6-β-葡聚糖的酶法检测程序 17,18（包括纽勤的酵母 β-葡聚糖酶法检测试剂盒（K-EBHLG）），但是目前尚无研究说明用于定量测定蘑菇子实体或菌丝体中 β-葡聚糖含量的酶法检测程序。到目前为止，许多用于测量蘑菇 β-葡聚糖的方法 19,20 都是基于 Prosky21,22 膳食纤维检测程序改良而来。
本手册介绍了一种间接测定蘑菇和菌丝体产品、酵母和真菌制剂中1,3:1,6-β-葡聚糖含量的方法 23。本方法使用淀粉葡糖苷酶、蔗糖酶和海藻糖酶水解淀粉、麦芽糊精、蔗糖和海藻糖中的 α-葡聚糖。如果样品中含有无法被这些酶水解的 α-葡聚糖，则会导致 β-葡聚糖的测定结果偏高。
本测定程序不适用于在其他 β-葡聚糖存在下的酵母/蘑菇 β-葡聚糖分析，例如纤维素（1,4-β-D-葡聚糖）。
原理：
将 1,3:1,6-β-葡聚糖、1,3-β-D-葡聚糖和 α-葡聚糖溶解于冰冷的 12 M 硫酸（H2SO4）中，然后在 2 M 硫酸中水解至接近完全 24,25。然后使用高纯度外切-1,3-β-葡聚糖酶和 β-葡萄糖苷酶的混合物将剩余的葡聚糖片段定量水解为葡萄糖。然后使用 GOPOD 试剂测定释放的 D-葡萄糖。这一步骤测定的是总葡聚糖含量。
淀粉、麦芽糊精、蔗糖和海藻糖中的 α-葡聚糖，通过与淀粉葡糖苷酶、蔗糖酶和海藻糖酶一起孵育水解。然后使用 GOPOD 试剂测定游离的 D-葡萄糖和水解过程中释放的 D-葡萄糖。
β-葡聚糖含量则为总葡聚糖与 α-葡聚糖的差值，计算方法如下文所述。
本检测试剂盒先前的检测程序采用的是总葡聚糖盐酸水解法（替代方法）。
关于检测程序变更的更多详细内容可参阅 McCleary 等人 23。
准确性：
标准误差通常小于 5%。
安全：
应遵守适用于所有化学物质的一般安全措施。关于安全使用和处理本产品的更多信息，请参阅 Megazyme 网站上提供的相关安全数据表。
试剂盒：
纽勤提供可进行 100 次测试的检测试剂盒。Megazyme 试剂盒包含完整的检测方法以及：
1 号瓶：（×2）
外切-1,3-β-葡聚糖酶与 β-葡萄糖苷酶硫酸铵悬浮液，2.0 mL。置于 4 °C 保存。有效期限请查看试剂瓶标签。
外切-1,3-β-葡聚糖酶与 β-葡萄糖苷酶硫酸铵悬浮液，2.0 mL。置于 4 °C 保存。有效期限请查看试剂瓶标签。
2 号瓶：
以 50%（v/v）丙三醇为溶剂的淀粉葡糖苷酶与蔗糖酶溶液，20mL。置于-10 ℃以下保存。有效期限请查看试剂瓶标签。注意：如置于 4 °C 保存，试剂有效期将缩短至 2 年以下。
3 号瓶：
GOPOD 试剂缓冲液。
缓冲液（50 mL，pH 7.4）。对羟基苯甲酸和叠氮化钠（0.09%）。置于 4 °C 保存。有效期限请查看试剂瓶标签。
4 号瓶：
GOPOD 酶试剂。葡萄糖氧化酶和过氧化物酶，以及 4-氨基安替比林。冻干粉。置于-10 ℃以下保存。有效期限请查看试剂瓶标签。
5 号瓶：
D-葡萄糖标准溶液（5 mL，1.00 mg/mL），溶于 0.2%（w/v）苯甲酸中。
置于室温下密封保存。有效期限请查看试剂瓶标签。
试剂溶液/悬浮液制备：
必要试剂（未提供）：
6 号瓶：
酵母 β-葡聚糖对照试剂（约 2 g，瓶身标签上标明 β-葡聚糖含量）。
置于室温下密封保存。有效期限请查看试剂瓶标签。
7 号瓶：
海藻糖酶悬浮液（5 mL）。置于 4 °C 保存。有效期限请查看试剂瓶标签。
试剂溶液/悬浮液制备：
1.向 1 号瓶中添加 9 mL 200 mM 乙酸钠缓冲液（pH 4.5）（即，将 1 号瓶内容物稀释至 11 mL）。得到溶液 1。
将溶液分成体积适当的多份等分溶液，并储存于聚丙烯管中。不使用时置于-10℃以下保存，可稳定 2 年以上。使用时将其置于冰上。仅在需要时稀释第二瓶内容物。
2. 直接使用 2 号瓶内容物。
3.用蒸馏水将 GOPOD 试剂缓冲液稀释定容至 1 L。得到溶液 2。现配现用。
注意：
1. 浓缩缓冲液在储存期间可能会形成盐晶体。在使用蒸馏水将该缓冲液稀释至1 L 时，这些晶体必须完全溶解。
2. 缓冲液中含 0.09%（w/v）叠氮化钠。叠氮化钠是一种有毒的化学物质，应按照相应要求小心处理。
4.用约 20 mL 溶液 2 溶解 4 号瓶内容物（GOPOD 酶试剂），并将得到的溶液定量转移至装有剩余溶液 2 的瓶中。用铝箔包裹容器，以避免瓶内试剂受到光的照射。得到的试剂为葡萄糖测定试剂（GOPOD 试剂）。在 4 ℃下可稳定 1 个月，在-10 °C 以下可稳定 12 个月。
如果 GOPOD 试剂需要冷冻保存，最好是将试剂分为多份等分溶液再进行保存。避免反复冻融。
新配制的溶液可能呈淡黄色或淡粉红色。置于 4°C 保存时可能呈深粉红色。
以蒸馏水为对照，该溶液的吸光度值应小于 0.05。
5. 直接使用 5 号瓶内容物。
6. 直接使用 6 号瓶内容物。
7.直接使用 7 号瓶内容物。首次打开瓶盖前，摇晃瓶身，将沉淀在橡胶瓶塞上的蛋白质与溶液混合均匀。随后，将储存瓶直立放置。
必要试剂（未提供）：
1. 乙酸钠缓冲液（200 mM，pH 4.5）。
将 11.6 mL 冰乙酸（1.05 g/mL）添加至 900 mL 蒸馏水中，并用 4 M（16 g/100mL）氢氧化钠溶液将 pH 值调节至 4.5。定容至 1L。
2. 乙酸钠缓冲液（1.2 M，pH 3.8）。
将 68.6 mL 冰乙酸（1.05 g/mL）添加至 800 mL 蒸馏水中，并用 4 M 氢氧化钠将 pH 值调节至 3.8。用蒸馏水定容至 1L。
3. 氢氧化钠（8.0 M）
在通风良好的通风柜中，将 320 g 氢氧化钠添加至 700 mL 蒸馏水中，搅拌溶解。将溶液冷却至室温，然后定容至 1L。
4. 氢氧化钠（1.7 M）
将 68 g 氢氧化钠添加至 800 mL 蒸馏水中，搅拌溶解。定容至 1L。
5. 硫酸（12 M，72% w/w）
在通风良好的通风柜中，小心地将 640 mL 浓硫酸（98%，比重为 1.835）添加至 300 mL 蒸馏水中。稀释定容至 1L 并混合均匀。
设备（推荐）：
1. 玻璃试管（圆底，16×100 mm，14 mL 容量）。
2. 康宁培养管。——螺口试管，20 ×125mm（Fisher Scientific，型号 FB59563）与试管盖（型号 FB51355）。
螺口试管，16×125 mm（Fisher Scientific，型号 FB59559）与试管盖（型号FB51354）。
3. 沸水浴装置。
4. 微量移液器：100 µL（例如 Gilson Pipetman® 或 Rainin EDP-2 ®电动分液器）。
5. 外置活塞式移液器，例如 Eppendorf Multipette® 。
-带 5.0 mL Combitip®分液管（用于移取 0.1 mL 水解样品等分溶液和 0.1mL 酶溶液）。
-带 3 个 50 mL Combitip®分液管（用于移取 2.0 mL 12 M 硫酸等分溶液、6 mL 8 M 氢氧化钠等分溶液和 3.0 mL GOPOD 试剂）。
6. 磁力搅拌器与搅拌子（5×15 mm）。
7. 分析天平。
8. 微量离心机——转速可达 13000 rpm。
9. 2.0 mL 一次性聚丙烯微量离心管。
10. 分光光度计（波长设置为 510 nm）。
11. 温度设定为 40 ℃的恒温水浴装置。
12. 旋涡混合器。
13. 离心磨碎机，12 齿转子，筛网孔径为 1.0 mm。
对照样品和注意事项：
A. 测定总葡聚糖含量（α-葡聚糖+β-葡聚糖）
B. 测定 α-葡聚糖
式中：
对照样品和注意事项：
1.本方法不适用于在其他 β-葡聚糖存在下分析酵母/蘑菇 β-葡聚糖，例如纤维素（1,4-β-D-葡聚糖）。
2.如果样品中含有无法被淀粉葡糖苷酶、蔗糖酶和海藻糖酶水解的 α-葡聚糖，则会导致 β-葡聚糖的测定结果偏高。
注意：
每组测定至少应包含一份酵母或蘑菇对照制剂。也应包含试剂空白样和 100μg 葡萄糖标准品（一式四份）。依照本方法的完整孵育过程，使用 GOPOD 试剂孵育对照样品和空白样。
试剂空白样：0.2 mL 乙酸钠缓冲液（200 mM，pH 4.5）+ 3.0 mL GOPOD试剂。
D-葡萄糖标准品：0.1 mL 5 号瓶内容物（D-葡萄糖标准品，1 mg/mL）+ 0.1mL 乙酸钠缓冲液（200 mM，pH 4.5）+ 3.0 mL GOPOD 试剂。
检测样品测得的吸光度不应高于 D-葡萄糖对照样品的吸光度。否则，应进一步稀释样品，以得出适当的吸光度。
测定酵母和蘑菇制剂中的 1,3:1,6-β-葡聚糖含量：
A. 测定总葡聚糖含量（α-葡聚糖+β-葡聚糖）
a. 总葡聚糖的溶解和部分水解
1. 将蘑菇或酵母样品置于离心磨碎机中磨碎，直至全部通过孔径为 1.0 mm 的筛网。
2.将磨碎的样品（约 90 mg，准确称取）添加至一个 20×12 mm 的 Fisher 品牌培养管中。轻轻敲击试管壁，确保所有样品落至管底。
3.向每个试管中添加 2.0 mL 冰冷的 12 M 硫酸，盖上管盖，将试管置于旋涡混合器上剧烈搅拌。将试管置于冰水浴中孵育 2 小时。定期将试管置于旋涡混合器上剧烈搅拌（多次搅拌，每次 10 至 15 秒）（确保 β-葡聚糖完全溶解）。
4.向每个试管中添加 4 mL 水，盖上管盖，将试管置于旋涡混合器上剧烈搅拌10 秒。然后添加 6 mL 水，盖上管盖，再次搅拌 10 秒。
5.松开管盖，将试管置于沸水浴（约 100 ℃）中。5 分钟后，拧紧管盖，继续孵育 2 小时。
6.将试管冷却至室温，然后小心拧开管盖。
7.使用一个装有 200 mM 乙酸钠缓冲液（pH 4.5）的水洗瓶，将试管内容物转移至一个 100 mL 的容量瓶中。每个试管重复相同操作。
8. 向容量瓶中添加 6 mL8.0 M 氢氧化钠溶液，用 200 mM 乙酸钠缓冲液（pH 4.5）定容至刻度线。颠倒试管，均匀混合内容物，并量取等分溶液，转移至微量离心管中。
9. 将等分溶液在 13000 rpm 下离心 5 分钟。
b. 测定总葡聚糖
1.量取 0.1 mL 过滤或离心萃取液的等分溶液（一式两份），并将其转移至玻璃
试管（16×100 mm）底部。
2.向每个试管中添加 0.1 mL 溶液 1 [外切-1,3-β-葡聚糖酶与 β-葡萄糖苷酶]，将
试管置于旋涡混合器上混合均匀，然后置于 40 °C 下孵育 60 分钟。
3.向每个试管中添加 3.0 mL GOPOD 试剂，然后置于 40 ℃下孵育 20 分钟。
4.对照试剂空白样，测定所有溶液在 510 nm 波长下的吸光度值。
B. 测定 α-葡聚糖
a. α-葡聚糖的溶解、水解和测定
1.将磨碎的样品（约 100 mg，准确称取）添加至一个 20×125 mm 的 Fisher 品牌培养管中。轻轻敲击试管壁，确保所有样品落至管底。
2.在每个试管中放入一个磁力搅拌子（5×15 mm），然后加入 2 mL 1.7 M 氢氧化钠溶液。将试管置于冰浴/水浴槽中，并置于磁力搅拌器上搅拌近20分钟，使颗粒悬浮。
3.向每个试管中添加 8 mL 1.2 M 乙酸钠缓冲液（pH 3.8），边加入边搅拌。立即添加 0.2 mL 2 号瓶内容物[淀粉葡糖苷酶与蔗糖酶]和 0.05 mL 7 号瓶内容物[海藻糖酶]，混合均匀，然后将试管置于 40 ℃的水浴槽中。
4.将试管置于 40 ℃下孵育 60 分钟，期间置于旋涡混合器上间歇搅拌。
5.对于 α-葡聚糖含量高于 10%的样品：（使用一个水洗瓶）将试管内容物定量转移至一个 100 mL 的容量瓶中，然后用水定容至刻度线。混合均匀。将等分溶液在 13000 rpm 下离心 10 分钟，或者用 Whatman 1 号滤纸（9 cm）过滤溶液。
6.对于 α-葡聚糖含量低于 10%的样品：将 2 mL 溶液转移至微量离心管中，在13000 rpm 下离心 5 分钟。对于这类样品，试管内的最终体积约为 10.35 mL（然而，不同分析样品的最终体积可能略有差异）。在有些情况下，计算时应适当考虑溶液体积的差异。
7.将稀释或未稀释的上清液的 0.1 mL 等分溶液（一式两份）转移至玻璃试管（16×100 mm）中，添加 0.1 mL 乙酸钠缓冲液（200 mM，pH 4.5）和 3.0 mLGOPOD 试剂，然后将试管置于 40 °C 下孵育 20 分钟。
8.对照试剂空白样，测定所有溶液在 510 nm 波长下的吸光度值。
注意：
蘑菇和酵母样品的 α-葡聚糖含量通常低于 10%。然而，一些商用蘑菇菌丝体生长在谷物上，在这种情况下，回收产品的淀粉含量可能高于 75% w/w23。
计算：
注意：可以使用 Mega-CalcTM 来简化这些计算。可访问 Megazyme 网站（www.megazyme.com）下载 Mega-CalcTM。
式中：
ΔA
=反应吸光度值-空白样吸光度值。
F
=将吸光度值转换为微克 D-葡萄糖的换算系数。
=100（µg D-葡萄糖标准品）
100 μg D-葡萄糖标准品的 GOPOD 吸光度值。
100/0.1 =总葡聚糖（酵母）的体积校正系数（从 100 mL 中量取 0.1 mL）。
103.5 =α-葡聚糖的体积校正系数（从 10.35 mL 中量取 0.1 mL）。
或者
1000
1000
=α-葡聚糖的体积校正系数（从 100 mL 中量取 0.1 mL）。
1/1000 =微克至毫克的换算系数。
100/W =转换为 100 mg 样品的换算系数（即，% w/w）。
W
=分析样品的质量。
162/180 =将测定的游离 D-葡萄糖转化为无水葡萄糖的系数，如发生在 β-葡聚糖
中。
标签：
β-葡聚糖（酵母和蘑菇）
