帕金森病造模方法盘点和技巧全解析
言归正传~帕金森病 (Parkinson’s disease, PD) 是继阿尔茨海默病之后第二大最常见的退行性疾病，常发生于中老年群体。PD 是多个基因和环境因素相互作用的结果，发病机制复杂。主要包括：氧化应激、线粒体功能障碍、α-突触核蛋白失衡、神经炎症、肠道微生物紊乱 (图 1)。
不过，基因模型的病理和行为表型通常与人类状况有差异。例如，几乎所有这些基因模型中都未发现多巴胺能神经元的显著损失 (PD 的主要病理特征)[3]。
图 2. 帕金森病的遗传动物模型[2]。
遗传模型是根据人类疾病中发现的基因突变进行调整的，如 SNCA (α-synuclein), LRRK2, DJ-1, Parkin, PINK1 基因突变等。这些基因是多巴胺能神经元功能的重要信号通路的一部分。
神经毒素包括 6-OHDA、MPTP 和鱼藤酮 (Rotenone)、百草枯 (Paraquat) 等。急性接触神经毒素会通过破坏线粒体功能和/或增加氧化应激而导致运动障碍和黑质纹状体多巴胺能细胞快速死亡，而长期服用神经毒素会诱发进行性模型，其中可能包括诱导 α-突触核蛋白聚集体生成 (图 3)。
图 3. 神经毒素诱导模型的发病机制[3]。
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MPTP：穿过血脑屏障，在神经胶质细胞中被 MAO-B 代谢为 MPP+，然后代谢为活性毒性化合物。MPP+ 随后被多巴胺转运蛋白吸收，通过抑制电子传递链的复合物 I 来损害线粒体呼吸，从而引起氧化应激和程序性细胞死亡分子途径的激活。
- Paraquat 和 6-OHDA 容易通过多巴胺转运蛋白穿过细胞膜，也可能通过靶向线粒体发挥毒性，随后产生 ROS 和醌，导致黑质纹状体多巴胺能神经元退化。
- Rotenone 具有极强的疏水性，容易穿透细胞膜，诱导 α‐突触核蛋白聚集体的形成和线粒体损伤，随后产生 ROS 和醌。
下面是小 M 为大家整理的 PD 神经毒素模型的方法、特点和应用，大家可以点赞收藏喔~
表 1. 神经毒素模型的方法、特点和应用[4][5][6][7][8]。
目前，MPTP 模型已成为最常用的模型。其是唯一已知的能够在人类和猴子中引起与 PD 临床表现相似的多巴胺能神经毒素。同时，MPTP 使用方便，不需要任何特殊设备 (例如立体定位框架)，也不需要像 6-OHDA 或鱼藤酮那样对活体动物进行手术。此外，MPTP 在全身给药后会产生可靠且可重复的黑质纹状体多巴胺能通路病变，而其他毒素通常不会出现这种情况[2]。
当然，在进行 MPTP 的造模时，也要注意鼠的选择，注射方式，给药方案等，提高造模成功率！
MPTP 的毒性作用会导致黑质纹状体损伤，纹状体多巴胺耗竭，黑质致密部 (SNpc) 和纹状体末端酪氨酸羟化酶 (Tyrosine hydroxylase, TH) 阳性神经元减少 (图 4)。
如何判断造模成功？[9][10]：
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黑质纹状体损伤: 造模成功后黑质和纹状体区域 TH 减少 (IHC, IF, WB 等方法都可以);
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大脑神经递质 DA, DOPAC, 5-HT, HVA 等减少 (可通过 HPLC 检测);
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黑质纹状体小胶质细胞 (IBA1+ cells) 和星形胶质细胞 (GFAP+ cells) 激活, 黑质区 α-syn 聚集体数量增加。
图 4. MPTP 造模后脑内多巴胺含量变化及 TH 阳性神经元免疫组化染色[2]。
A-C. 多巴胺 (DA) 及其主要代谢物 DOPAC 和 HVA 的含量变化。在第一次和最后一次 MPTP 注射（18 mg/kg, i.p. 分 4 次注射，间隔 2 小时）后 0.5-1.0 小时用药物治疗小鼠。药物继续使用 4 天。在最后一次 MPTP 给药后 7 天杀死小鼠。收集大脑，HPLC 测定多巴胺和代谢物水平。D-F. 黑质致密部 (SNpc) 和纹状体 TH 阳性神经元的免疫组化染色和定量。注射 MPTP 后第 7 天取脑染色，在注射盐水的对照组中，SNpc 和纹状体末端存在密集的 TH 阳性细胞体和纤维网络。注射 MPTP 后，SNpc 和纹状体中的 TH 含量急剧降低。
▐ Open Field Test 旷场试验
500×500×300 mm 旷场，旷场底面被平均分为 16 个 4×4 个小方格。正上方架摄像头，视野覆盖整个旷场。将动物放置在正中央格，同时进行摄像和计时，时间为 5 min。
通过计算机示踪分析系统分析实验动物的水平活动 (中央格停留时间、穿过中央格的次数、梳毛次数) 和直立次数，能够反映动物的焦虑情况。
▐ Rotarod test 转棒试验
将小鼠置于直径为 3 cm 的旋转杆上，转速调整为 30 r/min。记录小鼠从置于转棒到掉落转棒所经历的时间，测定时间为 1 min，每次中间休息 1 min，连续 5 次，并记录 1 min 内小鼠掉落次数，能够反映动物的运动协调能力。▐ Morris 水迷宫
水迷宫实验是评估啮齿类动物空间学习和记忆能力的经典程序，由一个圆形水池、水下平台以及一套图像自动采集和处理系统组成。
通过观测和记录动物学会在水箱内游泳并找到水下平台的耗时、游泳轨迹和搜索策略，分析和推断动物的学习、记忆和空间认知等方面的能力。
图 6. Morris 水迷宫示意图[12]。
▐ Pole test 爬杆测试
将一根 1 cm 粗、50 cm 长的木棒固定在实验台之上，用纱布绕棒包裹以防止小鼠攀爬滑动。将木棒竖直放置，将小鼠放置于木棒下方，计算小鼠到木棒上方并折返回到杆的底部的时间。每只小鼠完成 3 次，两次实验之间的间隔在 10 min 以上，取三次的平均时间作为最后结果。
▐ 酪氨酸羟化酶 (TH)
酪氨酸羟化酶 (Tyrosine Hydroxylase, TH) 负责催化 L-酪氨酸羟化并以四氢生物蝶呤 (BH4) 为辅酶生成左旋多巴。作为介导多巴胺生物合成的关键限速步骤，PD 动物模型黑质中 TH 阳性多巴胺能神经元会显著减少。
图 7. 小鼠纹状体 (Striatum) 和黑质 (SNpc) 中 TH 的免疫组化染色[13]。
▐ α-突触核蛋白 (α-synuclein)
帕金森病典型的病理学特征为 α-synuclein 在中脑黑质-纹状体区的异常聚集，造成多巴胺能神经元死亡。
图 8. 大鼠模型中纹状体内注射 α-syn-PFF 引起的突触前和突触后功能障碍[14]。
左图：在皮质区，注射 α-syn-PFFs 的大鼠检测到了一致比例的 p-α-syn+神经元。自发突触电流分析表明，背侧纹状体靶神经元中自发兴奋性突触后电流的频率增加，从而导致高谷氨酸能活动状态。右图：α-syn-PFF 大鼠的 SNpc 呈现多巴胺能神经元数量减少，表现为 TH+免疫荧光减少，与自发放电活动异常增加有关。中间图：在背外侧纹状体中，注射 α-syn-PFFs 导致 SPN 中皮质纹状体长期可塑性发生重大改变。还观察到 TH+纤维显著减少和 SNpc 终端内源性多巴胺释放减少.
实验方案：
20 mg/kg 或 23.4 mg/kg，腹腔注射，每隔 2 h 注射一次，一天内打 4 次。12 周雄性 C57BL/6N 小鼠。给药完 7 天后取材 (有文献表明急性给药后第7天黑质纹状体损伤达到稳定)[5]。
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纹状体 TH 平均清除率：60% (20 mg/kg)，79% (23.4 mg/kg)；
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黑质致密部 (SNpc) TH 平均清除率：43% (20 mg/kg)，47% (23.4 mg/kg)。
图 9. MCE MPTP 诱导小鼠帕金森病急性模型 TH 免疫组化染色。
A. 纹状体，B. 黑质萌家小贴士：
1. 造模小鼠不一定会出现帕金森病行为缺陷，小鼠个体差异性也较大,造模成功率一般难达 100%，因此在 MPTP 小鼠研究中要监测的主要表型是与神经胶质增生相关的黑质纹状体损伤，其程度取决于剂量和给药方案[1][4][5]。
2. 造模后可能会死亡：一个常见问题是动物在开始给药后的前 24 小时内急性死亡，雌性小鼠的死亡率较高。值得注意的是，急性死亡与大脑多巴胺能系统的损伤无关，有可能是由于外周心血管副作用。药物剂量高/小鼠体重小于 22 g/不同批次药物混用/小鼠没有提前适应/动物房太冷均有可能会导致小鼠死亡，每组动物数目建议增大。
3. 注射后，肉眼可以注意观察小鼠是否有活动性减弱、走路踉跄，抽搐、炸毛，排尿变多等表现，这种行为可能可以持续 24-48 h，此后小鼠表现基本正常。
今天给大家盘点了帕金森的不同模型的发生机制、不同的造模方式以及行为学/病理学评价等，主要给大家介绍了如何用 MPTP 造模，大家可以根据自己的实验需求选择合适的造模方式。如需帮助，可联系萌家线下销售经理或者技术获取技术支持，助您的实验一臂之力~
| MPTP hydrochloride 透过血脑屏障的多巴胺神经毒素，可用于诱导帕金森综合症模型 |
| 6-OHDA 一种广泛应用的神经毒素，可选择性破坏多巴胺能神经元 |
| Rotenone 线粒体电子传递链复合物 I 抑制剂 |
| Tyrosine Hydroxylase Antibody 酪氨酸羟化酶抗体 |
| alpha Synuclein Antibody (YA2073) α-突触核蛋白抗体 |
[1] Jankovic J, et al. Parkinson's disease: etiopathogenesis and treatment. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 2020 Aug;91(8):795-808.
[2] Jackson-Lewis V, et al. Protocol for the MPTP mouse model of Parkinson's disease. Nat Protoc. 2007;2(1):141-51.
[3] Javier Blesa, et al. Animal Models of Parkinson’s Disease. Challenges in Parkinson's Disease. 2016.
[4] Konnova EA, et al. Animal Models of Parkinson’s Disease. In: Stoker TB, Greenland JC, editors. Parkinson’s Disease: Pathogenesis and Clinical Aspects [Internet]. Brisbane (AU): Codon Publications; 2018 Dec 21. Chapter 5.
[5] Rabaneda-Lombarte N, et al. The CD200R1 microglial inhibitory receptor as a therapeutic target in the MPTP model of Parkinson's disease. J Neuroinflammation. 2021 Apr 6;18(1):88.
[6] Lee, et al. MPTP-driven NLRP3 inflammasome activation in microglia plays a central role in dopaminergic neurodegeneration. Cell Death Differ. 2019 Jan;26(2):213-22.
[7] Chen HX, et al. Exosomes derived from mesenchymal stem cells repair a Parkinson's disease model by inducing autophagy. Cell Death Dis. 2020 Apr 27;11(4):288.
[8] Ma XZ, et al. Gut microbiota-induced CXCL1 elevation triggers early neuroinflammation in the substantia nigra of Parkinsonian mice. Acta Pharmacol Sin. 2024 Jan;45(1):52-65.
[9] Rabaneda-Lombarte N, et al. The CD200R1 microglial inhibitory receptor as a therapeutic target in the MPTP model of Parkinson's disease. J Neuroinflammation. 2021 Apr 6;18(1):88.
[10] Sun MF, et al. Neuroprotective effects of fecal microbiota transplantation on MPTP-induced Parkinson's disease mice: Gut microbiota, glial reaction and TLR4/TNF-α signaling pathway. Brain Behav Immun. 2018 May;70:48-60.
[11] Kuniishi H, et al. Early deprivation increases high-leaning behavior, a novelanxiety-like behavior, in the open field test in rats. Neurosci Res. 2017 Oct;123:27-35.
[12] Pritchett D, et al. Searching for cognitive enhancement in the Morris water maze: better and worse performance in D-amino acid oxidase knockout (Dao(-/-)) mice. Eur J Neurosci. 2016 Apr;43(7):979-89.
[13] Lu Y, et al. Metabolic Disturbances in the Striatum and Substantia Nigra in the Onset and Progression of MPTP-Induced Parkinsonism Model. Front Neurosci. 2018 Feb 20;12:90.
[14] Calabresi P, et al. Alpha-synuclein in Parkinson's disease and other synucleinopathies: from overt neurodegeneration back to early synaptic dysfunction. Cell Death Dis. 2023 Mar 1;14(3):176.
