脂质纳米颗粒的发展和在药物递送系统中的应用
脂质纳米颗粒作为 COVID-19 mRNA 疫苗的重要组成部分，在有效保护 mRNA 和将 mRNA 转运到细胞的过程中发挥关键作用。裸的 DNA 或 RNA 在体液中容易被核酸酶迅速降解，难以在靶组织中积累。且免疫系统也能够识别并降解外源性的核酸引发免疫反应[1]。
基于 DNA 或 RNA 的基因疗法遇到的最大问题便是药物递送。为了实现安全有效的核酸递送，科学家们开发了脂质纳米颗粒（Lipid nanoparticle, LNP）以保护核酸不被降解，最大限度地向靶细胞递送，并减少核酸对脱靶细胞的暴露。
“脂质体”一词出现于上世纪六十年代，当时发现封闭的脂质双层囊泡能在水中自发形成。
脂质体是一种纳米载体，由一个或几个脂质双层组成，大小在 20 nM 到 1000 nM 之间，亲水性药物可以封闭在脂质体的水性内部区域，而疏水性药物可以包裹在脂双层的烃链区域中[1]。因此，脂质体被广泛研究用于药物输送。
脂质体能够稳定用于治疗的化合物并克服细胞和组织吸收的障碍[2][3]，改善化合物对疾病部位的靶向性，从而减少在非靶器官中的积累[4]。根据给药途径和疾病部位，结合不同递送平台的脂质体可以进一步改善封装化合物的递送。
图 1. 不同类型脂质体药物递送系统的示意图[4]。
(A) 传统脂质体；(B) 聚乙二醇化脂质体；(C) 配体靶向脂质体；(D) 治疗诊断脂质体。
脂质纳米颗粒是由一个 (单层) 或多个 (多层) 磷脂双层组成的球形囊泡，通常由四种成分组成：阳离子脂质 (Cationic lipids)、辅助脂质 (Helper lipids)、胆固醇 (Cholesterol) 和聚乙二醇化脂质 (Pegylated lipids, PEG-lipids) (图 2)。
图 2. 含有 mRNA 的脂质纳米颗粒的示意图[1]。
▐ 阳离子脂质
最早的脂质纳米颗粒使用的是阳离子脂质，其容易与带负电荷的核酸结合。但是这种基于阳离子脂质的递送系统在体内和体外都具有毒性和免疫原性。例如 DOTAP 和 DOTMA 可以被带负电荷的血清蛋白中和，导致毒性和功效降低[1]。作为一种替代方案，可电离的阳离子脂质（Ionizable cationic lipids）被开发出来，它减少了阳离子脂质纳米颗粒引起的毒性，同时保留了有效的转染特性。可电离的阳离子脂质（如 DLin-KC2-DMA 和 D-Lin-MC3-DMA）的可电离叔胺部分在酸性 pH 值下带净正电荷，但在血液循环系统中 (pH 7.4) 保持中性[5]。这种 pH 敏感性有利于核酸药物在体内的传递，因为保持中性的脂质纳米颗粒与血细胞阴离子膜的相互作用较少，从而提高了脂质纳米颗粒的生物相容性。
一般情况下，细胞通过内吞作用摄取脂质纳米颗粒。当脂质纳米颗粒进入 pH 值较低的内涵体中，可电离的阳离子脂质被质子化变得带正电荷，这促进内涵体膜的不稳定，使膜破裂，脂质纳米颗粒发生内涵体逃逸[6]。目前，有五种主要的可电离脂质类型广泛用于 RNA 递送[7]。
图 3. 可电离脂质和五种主要结构类别的可电离脂质破坏内体的机制[7]。
阴离子内体磷脂和质子化的可电离脂质形成的锥形离子对可以破坏双层结构，促进内体逃逸。根据其结构特性，RNA 递送的可电离脂质可分为不饱和（含有不饱和键）、多尾（含有两个以上尾）、聚合（含有聚合物或树枝状聚合物）、可生物降解（含有可生物降解键）和尾部支链脂质（包含分支尾部）。
▐ 聚乙二醇化脂质
聚乙二醇化脂质是另一种重要的脂质纳米颗粒成分，聚乙二醇脂质（如 DMG-PEG 2000 和 DSPE-MPEG-2000）是由亲水性聚乙二醇通过磷酸盐、甘油或其他连接物与疏水性烷基链结合而成。 聚乙二醇化脂质位于脂质纳米颗粒的表面，脂质结构域深埋在颗粒中，聚乙二醇结构域从表面伸出。
聚乙二醇化脂质可以延长脂质体的循环时间，因为聚乙二醇形成了一个空间屏障，防止血浆蛋白的结合，否则会导致它们被网状内皮细胞快速清除[8]。
此外，聚乙二醇化脂质还可以控制纳米颗粒的大小。这是因为在制造过程中低 pH 和乙醇环境将促进脂质纳米颗粒聚集融合，而聚乙二醇化脂质的位阻屏障防止了这种情况的发生，并有助于产生具有窄多分散性和小粒径的均匀颗粒群 (通常为50–100 nM)[8][9]。完全缺少聚乙二醇脂质的配方会产生不稳定的、多分散的脂质纳米颗粒[9]。
图 4. 聚乙二醇脂质含量对脂质纳米颗粒形态和大小的影响[10]。
▐ 胆固醇
胆固醇具有疏水性和刚性，可填充脂质体膜内脂质之间的空隙，促进囊泡的稳定性。胆固醇衍生物的分子几何结构可以进一步影响脂质纳米颗粒的递送效果和生物分布。辅助脂质多为磷脂（phospholipids)，如 DSPC 和 DOPE，通过促进与细胞和内体膜的融合，促进细胞摄取和内涵体释放。
已知超过 40% 治疗癌症的小分子药物在水中溶解度低，而脂质体作为药物递送系统能够封装这些药物并提高其水溶性，降低了药物对正常组织的毒性，延长了药物的停留时间。许多脂质纳米颗粒药物制剂已经被广泛应用于许多临床试验，作为抗癌、抗炎、抗生素、抗真菌、麻醉剂和其他药物和基因疗法的递送系统，尤其是在递送核酸药物领域。
例如，最早获批的脂质体药物 Doxil，一种抗肿瘤药物阿霉素的脂质纳米粒制剂，使用纳米颗粒延长在人血浆中的循环时间，同时降低阿霉素的心脏毒性[11]。
其次，核酸药物 Patisiran，一种在脂质纳米颗粒负载的 siRNA 药物，可减少肝脏中转甲状腺素蛋白的形成，最近获得 FDA 批准用于治疗遗传性转甲状腺素蛋白介导的淀粉样变性。它是最早获批脂质纳米颗粒制剂核酸药物，被视作核酸疗法发展的重要里程碑。
此外，脂质纳米颗粒最新的成功应用是 Pfizer/BioNTech 和 Moderna 获批上市的两种 COVID-19 mRNA 疫苗的递送载体。两种 mRNA 疫苗的脂质纳米颗粒的组成非常相似（图 5A）。
图 5. COVID-19 mRNA 疫苗脂质纳米颗粒[11]。
A：COVID-19 mRNA 疫苗脂质纳米颗粒的脂质成；B：COVID-19 mRNA 疫苗脂质纳米颗粒的脂质成分的结构。
不过，未经修饰的脂质纳米颗粒同样具有局限性。脂质纳米颗粒会在肝脏积聚，缺乏肝脏以外器官靶向选择性。
一篇题为"Lung-selective mRNA delivery of synthetic lipid nanoparticles for the treatment of pulmonary lymphangioleiomyomatosis" 的文章中，研究团队通过文库筛选发现 N 系列脂质（尾部含有酰胺键）制备的纳米颗粒能够选择性地将 Cre mRNA 递送到小鼠肺中，而且只要调整 N 系列脂质的头部结构就可以实现靶向不同的肺细胞类型（图 4）。
在 306-N16B LNP 中，33.6% 的肺内皮细胞被转染，1.5% 的上皮细胞和 1.9% 的巨噬细胞被转染。而 113-N16B LNP 优先将 Cre mRNA 传递给内皮细胞（占内皮细胞总数的 69.6%），但也传递给巨噬细胞 (18.9%) 和上皮细胞 (7.3%) 。这一研究有助于解决脂质纳米颗粒向肝脏以外器官（如肺和肾）的有效递送的问题。
图 6. 通过调整脂质的头部结构的头部结构，脂质纳米颗粒可以靶向不同类型的肺细胞[12]。
(A) 将 Cre mRNA 传递到 tdTomato 转基因 Ai14 小鼠腹部的示意图。(B, C) IVIS 成像系统拍摄的 Ai14 小鼠不同器官中 tdTomato 荧光的图像，共聚焦显微镜拍摄的肺组织的免疫荧光图像，以及通过流式细胞术对 306-N16B (B) 和 113-N16B (C) LNPs 定量分析 tdTomato 阳性细胞在肺部特定细胞类型中的百分比。
脂质纳米颗粒能够将不同药物（mRNA、siRNA和小分子药物等）包封并可控地输送到体内的特定部位，这使得它们对治疗多种疾病非常有用。随着相关技术的发展相信脂质纳米颗粒会帮助更多药物实现高效递送。
| DOTAP 一种阳离子脂质，可用于脂质纳米颗粒的合成。 |
| DOTMA 一种阳离子脂质，可用于脂质纳米颗粒的合成。 |
| DLin-KC2-DMA 一种阳离子脂质，可用于脂质纳米颗粒的合成。 |
| D-Lin-MC3-DMA 一种阳离子脂质，可用于脂质纳米颗粒的合成。 |
| ALC-0315 一种阳离子脂质，可用于脂质纳米颗粒的合成。 |
| ALC-0159 一种阳离子脂质，可用于脂质纳米颗粒的合成。 |
| SM-102 一种阳离子脂质，可用于脂质纳米颗粒的合成。 |
| 306-N16B 一种阳离子脂质，可用于脂质纳米颗粒的合成。 |
| 113-N16B 一种阳离子脂质，可用于脂质纳米颗粒的合成。 |
| DMG-PEG2000 一种聚乙二醇化脂质，可用于脂质纳米颗粒的合成 。 |
| DSPE-MPEG2000 一种聚乙二醇化脂质，可用于脂质纳米颗粒的合成。 |
| DSPC 一种磷脂，可用于脂质纳米颗粒的合成。 |
| DOPE 一种磷脂，可用于脂质纳米颗粒的合成。 |
| Cholesterol 胆固醇，可用于脂质纳米颗粒的合成 。 |
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参考文献：
[2] Ding BS, et al. Advanced drug delivery systems that target the vascular endothelium. Mol Interv. 2006 Apr;6(2):98-112.
[3] Hua S, et al. The use of lipid-based nanocarriers for targeted pain therapies. Front Pharmacol. 2013 Nov 21;4:143.
[4] Robson AL, et al. Advantages and Limitations of Current Imaging Techniques for Characterizing Liposome Morphology. Front Pharmacol. 2018 Feb 6;9:80.
[5] Kulkarni JA, et al. The current landscape of nucleic acid therapeutics [published correction appears in Nat Nanotechnol. 2021 Jul;16(7):841]. Nat Nanotechnol. 2021;16(6):630-643.
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[7] Han X, et al. An ionizable lipid toolbox for RNA delivery. Nat Commun. 2021 Dec 13;12(1):7233.
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[12] Qiu M, et al. Lung-selective mRNA delivery of synthetic lipid nanoparticles for the treatment of pulmonary lymphangioleiomyomatosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 2022;119(8):e2116271119.
