RT-PCR基本原理与实验步骤及常见问题的处理方案
1概述
反转录-聚合酶链式反应（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)，也称逆转录PCR，是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。其灵敏度比传统的RNA印迹法高1000〜10000倍，而所需时间缩短了几倍。迄今为止，RT-PCR的方法已经广泛应用于RNA的构造解析、cDNA的克隆及RNA水平上的表达解析等多种领域。
2 RT-PCR原理
RT-PCR是一种从细胞RNA (mRNA)中高效灵敏地扩增cDNA序列的方法，它由两大步骤组成：一步是反转录（RT)，另一步是PCR。获得总RNA或mRNA后，即可进行RT-PCR。首先，在反转录酶作用下将RNA(mRNA)反转录成cDNA，以该cDNA第一链为模板进行PCR扩增，根据靶基因设计用于PCR扩增的基因特异的上下游引物，基因特异的上游引物与cDNA第一链退火，在Taq DNA聚合酶作用下合成cDNA第二链。再以cDNA第一链和第二链为模板，用基因特异的上下游引物PCR扩增获得大量的cDNA。反应原理图如下。
4 RT-PCR实验步骤
4.1 RNA的提取
(1) 50-100mg组织或（5~10)×106个细胞，加入1mL Trizol试剂。对组织来说，需要在匀浆器中匀浆几分钟，至组织完全破碎。对培养细胞来说，可用移液器上下吹打或匀浆机破碎细胞。
(2) 4 ℃、12 000g离心10 min,转移上清。
(3) 上清室温放置5min，加0.2mL氯-仿，用手或Votex剧振15 s，室温放置2~3min。
(4) 4℃、11 000 g离心15 min,转移水相。
(5) 水相中加入0.25 mL异丙醇及0.25 mL高盐沉淀液（0.8mol/L的柠檬酸钠，1.2mol/L的 NaCl)混匀，室温放置10min。
(6) 4℃、11000 g离心10 min去上清。
(7) 加1 mL75%乙醇，Votex混匀，4℃、7000g离心5min，去上清。
(8) 沉淀在空气中干燥5~10 min,用100 μL DEPC水溶解，枪头吸打几次，放于 55℃水浴中10min促溶。
(9) 电泳及检测OD值，检定RNA的量及完整性。
(10) RNA放入-70℃保存。
4.2 mRNA的分离
(1) 检测起始RNA的量（起始RNA的量应小于或等于0.25mg）。将总RNA加入一个无RNase的1.5 mL Eppendorf管中，加入不含RNase的水至总体积为250 μL。
(2) 加入250μL的Buffer OBB和15μL的Oligotex悬浮液，完全混合溶液。
(3) 样品溶液放入70℃水浴中保温3 min。
(4) 从水浴中取出样品溶液，室温下放置10min。（这一步允许Oligotex粒子中的Oligo-dT30 和mRNA的poly-A尾巴杂交）
(5) 将样品溶液以最大速度（14000~18000 g)离心2min以沉淀Oligotex-mRNA 复合物，用移液器小心除去上清液。
(6) 用涡旋振荡器（Votex)或移液器将Oligotex-mRNA复合物沉淀重悬于400 μL或600 μL Buffer OW2中，然后将这些悬液加入到一个置于1. 5 mL微量离心管中的小离心柱（用于400 μL悬液）或大离心柱（用于600 μL悬液）中，以最大速度离心1 min。
(7) 转移离心柱到一个新的不含RNA酶的1.5 mL微量离心管中，然后加入400 μL或600 μL Buffer OW2到离心柱中，以最大速度离心1 min，并且弃掉离心液。
(8) 转移离心柱到一个新的不含RNA酶的1.5mL微量离心管中，加入 20-100 μL Buffer OEB (70℃预热）到柱子中，用移液器洗打溶液3~4次以重悬柱子上的Oligotex-mRNA复合物，以最大速度离心1 min。
(9) 为了获得最大的产量，再加入20-100 μL Bulfer OEB (70℃预热）到柱子中，然后用同样的方法重悬柱子中的Oligotex-mRNA复合物，以最大速度离心1min。为了减少洗脱体积，可以将第一次洗脱液重新加热到70℃后再用来进行另一次洗脱。但是如果要获得最大量的mRNA，则建议还是用新的Buffer OEB来洗脱。
4.3 RT-PCR
(1) 按下列组成配制RT-PCR反应液。
（2）以下条件进行RT-PCR反应。
反转录-聚合酶链式反应（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)，也称逆转录PCR，是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。其灵敏度比传统的RNA印迹法高1000〜10000倍，而所需时间缩短了几倍。迄今为止，RT-PCR的方法已经广泛应用于RNA的构造解析、cDNA的克隆及RNA水平上的表达解析等多种领域。
2 RT-PCR原理
RT-PCR是一种从细胞RNA (mRNA)中高效灵敏地扩增cDNA序列的方法，它由两大步骤组成：一步是反转录（RT)，另一步是PCR。获得总RNA或mRNA后，即可进行RT-PCR。首先，在反转录酶作用下将RNA(mRNA)反转录成cDNA，以该cDNA第一链为模板进行PCR扩增，根据靶基因设计用于PCR扩增的基因特异的上下游引物，基因特异的上游引物与cDNA第一链退火，在Taq DNA聚合酶作用下合成cDNA第二链。再以cDNA第一链和第二链为模板，用基因特异的上下游引物PCR扩增获得大量的cDNA。反应原理图如下。
3 一步法与两步法RT-PCR
常用的反转录PCR方法有两步法（Two-step RT-PCR)和一步法（One-step RT-PCR)两种。两者的区别与特点如下表所示。
常用的反转录PCR方法有两步法（Two-step RT-PCR)和一步法（One-step RT-PCR)两种。两者的区别与特点如下表所示。
4 RT-PCR实验步骤
4.1 RNA的提取
(1) 50-100mg组织或（5~10)×106个细胞，加入1mL Trizol试剂。对组织来说，需要在匀浆器中匀浆几分钟，至组织完全破碎。对培养细胞来说，可用移液器上下吹打或匀浆机破碎细胞。
(2) 4 ℃、12 000g离心10 min,转移上清。
(3) 上清室温放置5min，加0.2mL氯-仿，用手或Votex剧振15 s，室温放置2~3min。
(4) 4℃、11 000 g离心15 min,转移水相。
(5) 水相中加入0.25 mL异丙醇及0.25 mL高盐沉淀液（0.8mol/L的柠檬酸钠，1.2mol/L的 NaCl)混匀，室温放置10min。
(6) 4℃、11000 g离心10 min去上清。
(7) 加1 mL75%乙醇，Votex混匀，4℃、7000g离心5min，去上清。
(8) 沉淀在空气中干燥5~10 min,用100 μL DEPC水溶解，枪头吸打几次，放于 55℃水浴中10min促溶。
(9) 电泳及检测OD值，检定RNA的量及完整性。
(10) RNA放入-70℃保存。
4.2 mRNA的分离
(1) 检测起始RNA的量（起始RNA的量应小于或等于0.25mg）。将总RNA加入一个无RNase的1.5 mL Eppendorf管中，加入不含RNase的水至总体积为250 μL。
(2) 加入250μL的Buffer OBB和15μL的Oligotex悬浮液，完全混合溶液。
(3) 样品溶液放入70℃水浴中保温3 min。
(4) 从水浴中取出样品溶液，室温下放置10min。（这一步允许Oligotex粒子中的Oligo-dT30 和mRNA的poly-A尾巴杂交）
(5) 将样品溶液以最大速度（14000~18000 g)离心2min以沉淀Oligotex-mRNA 复合物，用移液器小心除去上清液。
(6) 用涡旋振荡器（Votex)或移液器将Oligotex-mRNA复合物沉淀重悬于400 μL或600 μL Buffer OW2中，然后将这些悬液加入到一个置于1. 5 mL微量离心管中的小离心柱（用于400 μL悬液）或大离心柱（用于600 μL悬液）中，以最大速度离心1 min。
(7) 转移离心柱到一个新的不含RNA酶的1.5 mL微量离心管中，然后加入400 μL或600 μL Buffer OW2到离心柱中，以最大速度离心1 min，并且弃掉离心液。
(8) 转移离心柱到一个新的不含RNA酶的1.5mL微量离心管中，加入 20-100 μL Buffer OEB (70℃预热）到柱子中，用移液器洗打溶液3~4次以重悬柱子上的Oligotex-mRNA复合物，以最大速度离心1 min。
(9) 为了获得最大的产量，再加入20-100 μL Bulfer OEB (70℃预热）到柱子中，然后用同样的方法重悬柱子中的Oligotex-mRNA复合物，以最大速度离心1min。为了减少洗脱体积，可以将第一次洗脱液重新加热到70℃后再用来进行另一次洗脱。但是如果要获得最大量的mRNA，则建议还是用新的Buffer OEB来洗脱。
4.3 RT-PCR
(1) 按下列组成配制RT-PCR反应液。
（2）以下条件进行RT-PCR反应。
（3）反应结束后，取PCR反应液（5-10μL）进行琼脂糖凝胶电泳，确认RT-PCR反应产物。如果此PCR产物需要用于以后实验，必将PCR产物放于-20℃冷冻保存。
5 RT-PCR常见问题解析
一步RT-PCR和两步RT-PCR方法哪个更好？应该怎么选择？
一步RT-PCR的最大优点是操作简单，因此可避免样品间的交叉污染。但我们的实践经验表明，在大多数情况下，应首先考虑两步RT-PCR法，而不是一步RT-PCR法，因为两步RT-PCR法产物的产量一般高于一步RT-PCR法；此外两步法具有更大的灵活性，可以分别优化RT和PCR两步反应，而无需考虑它们之间的干扰。
RT-PCR以总RNA作为模板还是以mRNA作为模板好？
提取总RNA还是mRNA取决于实验目的。一般情况下（如克隆基因或比较不同样品间基因表达水平时），提取总RNA即可作为RT-PCR的模板。这样可以减少获得cDNA的实验步骤，从而减少实验误差。另外，分离总RNA要比分离mRNA少用一些试剂，因此更经济。但是若要构建cDNA文库，则需要分离mRNA作为模板，以便提高cDNA文库的质量。
如何保证作为RT-PCR实验模板的总RNA的数量和质量？
RT-PCR能否成功的关键之一是提取的总RNA的数量和质量。要想保证获得高质量的总RNA,有两点需要特别注意：
(1) Trizol试剂的选择。尽管有很多国内公司都提供廉价的Trizol试剂出售，但还是强烈推荐购买质量更可靠的Invitrogen等公司的Trizol试剂。
(2) 提取RNA过程，必须特别小心，严格按照要求操作，以防止RNA的降解。
如何防止提取RNA过程中RNA的降解？
主要注意以下几点：
(1) 实验过程中使用的玻璃器皿使用前可于180 ℃干烤8h以上，塑料制品要用氯-仿冲洗。焦磷酸二乙酯（DEPC)是RNase酶的强烈抑制剂，RNA提取过程和反转录过程中所用的水要用DEPC处理。
(2) 操作人员的手是RNase的重要污染源，进行RNA实验时应始终戴手套，并应勤换手套。
(3) 提取的样品材料应尽可能新鲜，如果不能及时提取RNA，取样后应保存于液氮中。
如何选择反转录引物？
两步法中反转录引物有Oligo（dT）（12-18个核苷酸组成）、随机六聚寡核苷酸和基因特异引物，可根据不同的目的选择不同的引物。Oligo（dT）引物能与哺乳动物mRNA的3'端poly（A）尾巴互补，作为一种通用引物用于cDNA第一链的合成。随机六聚寡核苷酸引物能与RNA模板的许多位点互补，因此，当RNA序列很长（＞3kb)或其中包含很多二级结构使Oligo (dT)或基因特异引物很难与mRNA互补时，选择随机六聚寡核苷酸引物不失为一种良策。
基因特异引物能与靶mRNA的某一区域互补，该引物可用作 PCR反应中的下游引物。基因特异引物在细胞内靶mRNA含量较低时较为有用。
当用基因特异引物进行反转录时，需注意引物的浓度和退火温度。一般而言，用Oligo (dT)获得的RT-PCR产物特异性比随机六寡核苷酸获得的RT-PCR产物的特异性高。一步法中所用引物为基因特异引物，因此选择余地比两步法少。一步RT-PCR中两条引物的其中一条既应在RT中发挥作用，又应在PCR中发挥作用。为兼顾RT和PCR,引物的退火温度一般在45~65℃之间。为增加一步RT-PCR产物的量，引物浓度可增加到0.6 μmol/L。引物最好设计在离mRNA 3'末端4 kb区域以内，扩增长度小于1.5 kb。
RT-PCR的产物产率很低是什么原因？
可能是因为反转录cDNA合成效率低，但更多情况下是因为cDNA扩增效率低。为了验证后者的可能性，可建立一系列PCR反应，这些PCR反应中加入了不同数量的模板。 假如染色后的凝胶上呈现不清晰的成片状的非特异性条带，这种实验结果往往是在PCR中加入过量的cDNA模板所致。因此，在许多PCR实验中用反转录反应产生的cDNA的10%作为模板。在这种情况下，PCR扩增阶段需要另加模板。具体最适合的模板量，要靠预实验确定。一旦建立了模板的最佳浓度，其他的PCR参数可用系统的方式如改变 Mg2+浓度和复性条件来进一步优化。
上述调整后RT-PCR的产物产率依然很低，怎么办？
可依次采取以下步骤：
(1) 通过含有甲醛的琼脂糖凝胶电泳来检査RNA的完整性。
(2) 建立含有对照mRNA、Oligo (dT)引物和放射性元素标记示踪物的检测反应来检测cDNA的合成效率。
(3) 将不同比例的RNA样品和对照样品混合，通过比较cDNA的产量来检测RNA样品中是否存在抑制剂。
(4) 在继续进行PCR之前，纯化cDNA第一链的样品。
RT-PCR反应后，无PCR产物，怎么办？
首先应严格按照说明书要求，进行Control反应。如果对照正常，说明实验操作方面没有问题。应从RNA样品的纯度和添加量、引物的设计情况、参考文献的可信度以及RT-PCR条件的设定等方面加以考虑；如对照反应不正常，应从实验操作的准确性、实验器具的处理、PCR仪的条件设定等方面加以考虑。
有些RT反应体系中，不加dNTP混合物，为什么？
由于在这些RT反应体系中已经加了足够量的dNTP Mixture，因此在PCR反应中，不须再添加dNTP。如果在PCR反应时继续添加，虽然PCR反应仍可进行，但可能会降低DNA的扩增效率。
5 RT-PCR常见问题解析
一步RT-PCR和两步RT-PCR方法哪个更好？应该怎么选择？
RT-PCR以总RNA作为模板还是以mRNA作为模板好？
如何保证作为RT-PCR实验模板的总RNA的数量和质量？
(1) Trizol试剂的选择。尽管有很多国内公司都提供廉价的Trizol试剂出售，但还是强烈推荐购买质量更可靠的Invitrogen等公司的Trizol试剂。
(2) 提取RNA过程，必须特别小心，严格按照要求操作，以防止RNA的降解。
如何防止提取RNA过程中RNA的降解？
(1) 实验过程中使用的玻璃器皿使用前可于180 ℃干烤8h以上，塑料制品要用氯-仿冲洗。焦磷酸二乙酯（DEPC)是RNase酶的强烈抑制剂，RNA提取过程和反转录过程中所用的水要用DEPC处理。
(2) 操作人员的手是RNase的重要污染源，进行RNA实验时应始终戴手套，并应勤换手套。
(3) 提取的样品材料应尽可能新鲜，如果不能及时提取RNA，取样后应保存于液氮中。
如何选择反转录引物？
基因特异引物能与靶mRNA的某一区域互补，该引物可用作 PCR反应中的下游引物。基因特异引物在细胞内靶mRNA含量较低时较为有用。
当用基因特异引物进行反转录时，需注意引物的浓度和退火温度。一般而言，用Oligo (dT)获得的RT-PCR产物特异性比随机六寡核苷酸获得的RT-PCR产物的特异性高。一步法中所用引物为基因特异引物，因此选择余地比两步法少。一步RT-PCR中两条引物的其中一条既应在RT中发挥作用，又应在PCR中发挥作用。为兼顾RT和PCR,引物的退火温度一般在45~65℃之间。为增加一步RT-PCR产物的量，引物浓度可增加到0.6 μmol/L。引物最好设计在离mRNA 3'末端4 kb区域以内，扩增长度小于1.5 kb。
RT-PCR的产物产率很低是什么原因？
上述调整后RT-PCR的产物产率依然很低，怎么办？
(1) 通过含有甲醛的琼脂糖凝胶电泳来检査RNA的完整性。
(2) 建立含有对照mRNA、Oligo (dT)引物和放射性元素标记示踪物的检测反应来检测cDNA的合成效率。
(3) 将不同比例的RNA样品和对照样品混合，通过比较cDNA的产量来检测RNA样品中是否存在抑制剂。
(4) 在继续进行PCR之前，纯化cDNA第一链的样品。
RT-PCR反应后，无PCR产物，怎么办？
有些RT反应体系中，不加dNTP混合物，为什么？
