脂肪酶（Lipase，LPS）活性试剂盒使用说明书

 
注   意 ：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：
LPS又称甘油酯水解酶，催化甘油三酯水解生成脂肪酸和甘油（或者甘油二酯和单酯）。LPS广泛的存在于各种生物中。血清中LPS的异常增高常见于胰腺炎和胰腺癌。 

测定原理：
LPS催化油酯水解成脂肪酸，利用铜皂法测定脂肪酸生成速率，即可计算LPS活性。

自备仪器和用品：
研钵、台式离心机、震荡混匀器、可见分光光度计、1mL玻璃比色皿、可调式移液枪、甲苯100mL、冰和蒸馏水。

试剂组成和配制：
试剂一：液体90mL×1瓶，4℃保存。
试剂二：液体14mL×1瓶，4℃保存。每次使用前用震荡混匀器剧烈震荡20min。
试剂三：甲苯100mL×1瓶，4℃保存（自备）。
试剂四：液体20mL×1瓶，4℃保存。
标准品：液体10μL×1瓶，10 µmol/mL的标准溶液，4℃保存。临用前加入3.168 mL甲苯，充分溶解。

粗酶液提取：

• 组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）进行冰浴匀浆。12000g，4℃离心10min，取上清置冰上待测。
• 细菌、真菌：按照细胞数量（10⁴个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后12000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。
• 血清等液体: 直接检测。

LPS测定操作：

• 分光光度计预热30 min以上，调节波长到710 nm，蒸馏水调零。
• 试剂一和试剂二置于37℃水浴预热30min以上。
• 在5mL EP管中依次加入下列试剂

 

试剂名称（μL）	空白管	测定管
蒸馏水	375
样本		125
试剂一	750	750
试剂二		250

试剂三

2000

2000

试剂名称（μL）	空白管	测定管	标准管
上清液	1200	1200

标准品			1200
试剂四	300	300	300

LPS活性计算公式：
1. 组织、细菌或细胞LPS活性
（1）按照蛋白浓度计算
活性单位定义：37℃中每毫克蛋白每分钟水解橄榄油生成1μmol脂肪酸为一个酶活单位。
LPS (μmol/min/mg prot) = [C标准品×(A测定管-A空白管)÷（A标准管- A空白管）]×V反总÷（Cpr×V样）÷T=16×[(A测定管－A空白管)÷（A标准管- A空白管）]÷Cpr
（2）按照样本质量计算
活性单位定义：37℃中每克组织每分钟水解橄榄油生成1μmol脂肪酸为一个酶活单位。
LPS (μmol/min/g 鲜重) = [C标准品×(A测定管-A空白管)÷（A标准管- A空白管）]×V反总÷（W×V样÷V样总）÷T=16×[(A测定管－A空白管)÷（A标准管- A空白管）]÷W
（3）按照细菌或者细胞数量计算
活性单位定义：37℃中每10⁴个细胞每分钟水解橄榄油生成1μmol脂肪酸为一个酶活单位。
LPS (μmol /min/10⁴cell) = [C标准品×(A测定管-A空白管)÷（A标准管- A空白管）]×V反总÷（细胞数量×V样÷V样总）÷T=16×[(A测定管－A空白管)÷（A标准管- A空白管）]÷细胞数量
2. 血清等液体LPS活性
活性单位定义：37℃中每毫升血清每分钟水解橄榄油生成1μmol脂肪酸为一个酶活单位。
LPS (μmol /min/mL) = [C标准品×(A测定管－A空白管)÷（A标准管- A空白管）]×V反总÷V样÷T
=16×[(A测定管－A空白管)÷（A标准管- A空白管）]
C标准品：10 µmol/mL；V反总：反应总体积，2mL；V样：反应中加入样本体积，0.125mL；V样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL，需要另外测定，建议使用本公司BCA蛋白质含量测定试剂盒；W：样本质量，g；T：催化反应时间，10 min。