考马斯亮蓝法测蛋白含量测定试剂盒使用说明书

 
注    意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义：
样品可溶性蛋白质含量常常用于酶活性计算。此外，可溶性蛋白质含量也用于食品等质量分析。
 
测定原理：
在酸性溶液中，考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合形成蓝色复合物；该复合物在620nm处有最大吸收峰， 其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比。该方法灵敏度高，适合微量蛋白质分析。
 
自备仪器和用品：
离心机、分光光度计、石英比色皿、移液器和蒸馏水。
 
试剂组成和配制：
试剂一：液体30 mL×1瓶，4℃保存。
 
样品中可溶性蛋白质提取：

• 液体样品：澄清液体样品可以直接测定。
• 组织样品：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：20的比例（建议称取约0.05 g组织，加入1mL提取液（自备，根据需要选用酶提取缓冲液或者蒸馏水或者生理盐水））

冰浴匀浆，8000g，4℃离心10min，取上清，即待测液。（动物样品常常需要稀释）

• 细菌、真菌：按照细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后8000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。

 
测定操作：
1. 分光光度计预热30 min，蒸馏水调零。
2. 在石英比色皿中加入：

试剂（μL）	测定管	空白管
样本	500
蒸馏水		500
试剂一	500	500
混匀后，测定波长620 nm吸光值，△A=A测定-A空白。

注意：空白管只需要测定一次。
 
计算公式：
标准曲线：y = 14.253x - 0.0007  R² = 0.9997    x: 蛋白标准品浓度(mg/mL)    y: 吸光值差值
1.按液体样本体积计算：
Cpr（mg/mL）=(△A+0.0007)÷14.253=0.07×(△A+0.0007)
2.按组织样本质量计算：
Cpr（mg/g）=(△A+0.0007)÷14.253×V总÷W=0.07×(△A+0.0007)÷W
V总：提取液体积，1 mL; W：样本质量，g。