烟草花叶病毒探针法荧光定量RT-PCR试剂盒使用方法

一、稀释标准曲线样品
（以10E1-10E6拷贝/μL这6个10倍稀释度为例）。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的DNA片段作为阳性对照。
■标记6个离心管，分别为6，5，4，3，2，1。
■用带芯枪头分别加入45 μL荧光RT-PCR专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同）。
■在6号管中加入5 μL 1×10E7拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1×10E6拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
■换枪头，在5号管中加入5 μL 1×10E6拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E5拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
■换枪头，在4号管中加入5 μL 1×10E5拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E4拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
■重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

二、样品RNA的制备
■如果有N个样品，最好设置N+2个提取，多出的一个是PC（样品制备阳性对照），一个是NC（样品制备阴性对照）。可以用10μL上步所得4号稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为PC。另外用水作为NC。
■用自选方法纯化样品的RNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒RNA提取试剂盒兼容。也可以选购本公司的柱式病毒RNAout。

三、Probe qRT-PCR反应（20μL体系，在样品制备室进行）
■如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+9个RT-PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于RT-PCR阴性对照（用水做模板），6个用于标准曲线。如果做定性分析并且只做1次重复，则标记N+4个RT-PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于RT-PCR阴性对照（用水做模板），1个用于RT-PCR阳性对照（直接用第6步第4号管的阳性对照稀释液做模板）。下面只以定量分析为例描述操作步骤。
■在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加）：

成分	样品管 N+2个	RT-PCR阴性对照	标准曲线样品管 （1-6管）
2×Probe qRT-PCR MagicMix	各10 μL	10 μL	各10 μL
烟草花叶病毒RT-PCR 引物-探针混合液	各3 μL	3 μL	各3 μL
N+2个待测RNA样本	各7 μL	不加	不加
超纯水	不加	7 μL	不加
第6步所得标准曲线样品稀释液（1-6号）	不加	不加	各7μL（2号样到2号管，3号样到3号管…）

■盖上盖子后上机，按下面参数进行RT-PCR：

过程	温度	时间
逆转录	42℃	30 min
预变性	95℃	3 min
RT-PCR反应 （45个循环）	95℃	15 sec
	60℃	1 min（采集FAM通道的荧光信号）

四、数据处理
■如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品RNA浓度的log值，再推算出其浓度。
■如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照Ct必须大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于35。对待测样品，如果其Ct大于或等于40则为阴性，如果小于或等于35则为阳性。如果在35-40之间，则重复一次。重复实验的Ct值如果大于或等于40则为阴性，如果小于40，则为阳性。