糖蛋白标志物研究工具——凝集素芯片

 
       糖基化是Z为广泛和复杂的蛋白质共翻译或翻译后修饰之一，它是通过糖基转移酶，在新生多肽或者成熟蛋白质的特定氨基酸上添加多个单糖的过程，通俗的理解就是在细胞器内“出厂”的蛋白质上添加各种糖链“标签”的过程。人体内至少50%的蛋白质都会发生糖基化修饰。这类修饰与蛋白质的正确折叠、构象稳定性及分泌等密切相关，并影响多种生理学过程，如分子间识别、细胞的粘附、免疫反应、肿瘤的侵袭转移等。
 

 这样一种重要的修饰“标签”不仅会因蛋白质本身的动态多样性而在不同类型的样本中呈现丰度和类别差异，还会因各种生理或病理条件而在同类型的样本中发生变化，表现出高度的复杂性和异质性。那么有没有一种工具可以在全局的角度，快速地描绘出样本总体的糖基化修饰图谱呢？答案是——凝集素芯片。 
 

 上海儿童医学中心检验科杨蔺主任与华盈生物研发团队、上海交通大学陶生策教授课题组一起展开合作，以社区获得性肺炎为研究对象，通过凝集素芯片筛选血清糖基化谱，进一步结合质谱分析，找到潜在的肺炎血清诊断糖蛋白标志物HPR，有助于对儿童非细菌性肺炎与细菌性肺炎的鉴别诊断，相关研究成果于6月12号在线发表在学术期刊《Proteomics - Clinical Applications》上。

       

        
         该研究的论文作者有多名来自华盈生物研发团队，成功应用了华盈生物新建立的凝集素芯片-标志物研发方案 ，综合了蛋白芯片与质谱两种蛋白组学技术，为复杂疾病的临床标志物开发提供了新的研究思路，具有借鉴意义。也充分体现了华盈生物专业化技术服务的理念与研发实力。

 

研究思路解析：

 

 

第1步：明确研究目的

社区获得性肺炎(community acquired pneumonia, CAP)是儿童（尤其是婴幼儿）常见感染性疾病，也是5岁以下儿童死亡的首位病因。CAP常见病原体包括细菌、病毒、支原体、衣原体等。但不同病原体感染的婴幼儿早期症状无明显差别，传统的诊断方法存在不足，难以实现早期及时有效的诊断，因而临床上以经验性的广谱抗生素治疗为主，导致耐药以及部分患儿未及时针对性用药而延误病情的风险增加。因此临床上儿童肺炎尚缺乏有效的早期鉴别诊断标志物。

 
第2步：凝集素芯片助力血清糖基化谱筛选

前面提到，由于蛋白糖基化修饰的广泛性，无论病理条件下特定蛋白本身数量发生变化，还是糖基转移酶调控的修饰程度、类型发生变化，都可能导致样品中糖链“标签”的差异累积并呈现在整体水平上。而凝集素就是一种可以识别这类“标签”的工具蛋白，制备成蛋白芯片后大大提高了可以同时检测的“标签”通量（详见后文介绍），因此研究人员从蛋白糖基化筛选入手，应用凝集素芯片对正常儿童(NC)、支原体肺炎患儿(M)和细菌性肺炎患儿(B)的血清糖基化谱进行筛选。芯片结果显示，有4个凝集素（CALSEPA、MIA、PAA 、SNA-I）在不同组间有明显的差异结合信号，在总体水平上反映出不同血清样品中特定蛋白糖链的丰度差异。
 

 

图1 凝集素芯片筛选糖基化谱

 
第3步：凝集素芯片结果验证与延伸

其中，研究人员选取SNA-I进行lectin blot实验对筛选结果进行验证。和芯片检测一致，结果显示支原体肺炎组检测信号明显高于正常对照组和细菌性肺炎组。进一步发现，差异结合信号集中在42 kDa分子量附近，推测该分子量附近的蛋白可能有糖基化的上调或者蛋白表达量的上调。因此研究人员结合考马斯亮蓝染色结果进行分析，发现支原体肺炎组中42 kDa附近蛋白表达量有明显增加，并且和SNA-I的结合信号差异相关性很高（见图2），由此推测SNA-I结合信号的差异可能是由于42 kDa附近蛋白表达量增加导致的。
 

 

 

图2 lectin blot验证凝集素芯片结果

 
第4步：关键糖蛋白鉴定

 为了进一步明确是哪个蛋白的表达量发生了上调，研究人员以凝集素SNA-I为钓饵，进行了pull down实验。血清pull down产物（P-M3）经电泳分离后，对42 kDa分子量附近的蛋白条带进行了质谱鉴定。结果显示，高同源性蛋白HP和HPR的鉴定分值Z高。随后通过western blot验证，发现HPR在支原体肺炎组（M组）中表达量明显上调，如图3。
 

 

图3  HPR可能是潜在的肺炎诊断标志物 

第5步：HPR标志物评判

        最后，研究人员应用western blot技术对更多例数的血清样品进行检测。结果显示：肺炎组的HPR水平要高于健康对照组（p＜0.001），并且与细菌性肺炎组相比，HPR表达水平在非细菌性肺炎组（支原体肺炎组和病毒性肺炎组）更高（p＜0.05），如图4。表明HPR可以作为潜在的儿童肺炎诊断指标，并且具有针对儿童细菌性肺炎与非细菌性肺炎的鉴别诊断的潜力。
 

 

 

图4  HPR标志物评判

小科普：揭开凝集素芯片的神秘面纱~
       凝集素（Lectin）是一类自然界广泛存在的蛋白质，具有识别特定糖结构的特性。利用凝集素进行糖结构的解析是糖相关生物学研究领域的常用手段，迄今发现超过300种，并且已有近100多种能通过商业途径获得。华盈生物提供的凝集素芯片是将商业途径获得的55种经典凝集素，以微阵列的形式固定在高分子三维芯片片基上，形成高通量凝集素芯片，可进行多种糖结构的同步筛选和交叉验证。随着近年来糖组学研究的兴起和蓬勃发展，越来越多的蛋白被证实具有糖基化修饰，同时其在生命活动中的重要性越来越被认可。该芯片的诞生不仅为专注于糖基化相关研究的科研工作者提供了有力的工具，也为广大其它研究领域的科研工作者提供了新的研究视角和技术手段。

 

凝集素芯片特点：

• 芯片基片：高分子三维基片，75*25 mm

• 凝集素种类：55种

• 点体积：0.5~1 nL/点

• 点重复：3次

• 可检测样品：14个

 

凝集素芯片应用:

• 特定蛋白表面糖链结构检测

  Functional glycosylation of human podoplanin: Glycan structure of platelet aggregation-inducing factor. （FEBS Lett.  PMID: 17222411）

• 完整细胞表面糖基化谱检测

  Lectin RCA-I specifically binds to metastasis-associated cell surface glycans in triple-negative breast cancer.  (Breast Cancer Res.  PMID: 25848723)

• 组织或细胞裂解液糖基化差异筛选

  Molecular imaging using fluorescent lectins permits rapid endoscopic identification of dysplasia in Barrett's esophagus. (Nat Med.  PMID: 22245781)

• 唾液样本糖基化检测

  Age- and Sex-Associated Differences in the Glycopatterns of Human Salivary Glycoproteins and Their Roles against Influenza A Virus. (J Proteome Res.  PMID: 23590532)

• 石蜡包埋样本检测

  A systems biology approach identifies FUT8 as a driver of melanoma metastasis. (Cancer Cell.  PMID: 28609658)（参见案例解析）