植物Rubisco测定试剂盒说明书

植物Rubisco测定试剂盒
● 产品组成：Plant Rubisco Assay Kit

组分货号	名称	规格	贮存	运输
PU1060-01	试剂1-Rubisco提取缓冲液（2×）	100 ml	4℃	常温
PU1060-02	试剂2-10×Assay buffer	15 ml	-20℃	常温
PU1060-03	试剂3-GAPDH（200×）	1 KU	-20℃	常温
PU1060-04	试剂4-PGK（100×）	500 U	4℃	常温
PU1060-05	试剂5-CPK（100×）	1 KU×2	-20℃	常温
PU1060-06	试剂6-ATP（100×）	1.2 ml	-20℃	常温
PU1060-07	试剂7-CrP（100×）	1.2 ml	-20℃	常温
PU1060-08	试剂8-NADH（100×）	1.2 ml	-20℃	常温
PU1060-09	试剂9-RuBP	1.4 ml×2	-20℃	常温
PU1060-10	试剂10-酶溶解缓冲液	5 ml	-20℃	常温
DE005	试剂11-灭菌水	100 ml	4℃	常温
BSA-02	试剂12-BSA溶液 50mg/ml	5 ml	-20℃	常温
DT0140P	试剂13-1MDTT（100×）	1 ml×2	-20℃	常温
PC2030-01	蛋白酶抑制剂 植物样品提取用(100×)	1 ml	-20	常温

●     产品简介：
核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(Rubisco)是光合作用碳代谢中的重要的调节酶，是植物中最丰富的蛋白质，主要存在于叶绿体的可溶部分，总量约占叶绿体可溶蛋白50％～60％。

这里1分子CO₂被固定，就有2分子 NADH 被氧化。因此，由NADH氧化的量就可计算Rubisco的活性，由340nm吸光度的变化可计算NADH氧化的量。
为了使NADH的氧化与CO₂的固定同步，需要加入磷酸肌酸(CrP)和磷酸肌酸激酶(CPK)的ATP再生系统。

 按照一次使用0.5 ml 试剂1-Rubisco提取缓冲液（2×）计算，试剂盒可以测定200个样品。
● 自备材料：
植物材料；剪刀；液氮；研钵或其他研磨设备；1.5ml离心管；1ml石英比色皿；紫外分光光度计；制冰机；低温离心机
● 操作步骤：
一、 即用型Rubisco提取缓冲液配制：

	一个反应配制体积	n个反应配制体积
	1 ml	n×1 ml
Rubisco提取缓冲液（2×）	0.5 ml	n×0.5 ml
灭菌水	470 μl	n×470 μl
1 M DTT（100×）	10 μl	n×10 μl
BSA溶液50mg/ml	20 μl	n×20μl
蛋白酶抑制剂（100×）	10 μl	n×10μl

注：1. 即用型Rubisco提取缓冲液尽量现配现用，短期4℃中可以过夜保存。
2. 为增强Rubisco的稳定性，提取缓冲液中可以加入蛋白酶抑制剂（Cat：PC2030）
二、 Rubisco样品提取：
1. 取新鲜植物组织，清洗干净，擦干，液氮中研磨，1 cm²叶片（1分硬币大小）或0.1g粉末加入1 ml 即用型Rubisco提取缓冲液，颠倒混匀，冰浴放置5-10分钟。
2.12000g4℃离心 10分钟，上清即为Rubisco样品提取液，常温放置备用（不要冰浴或4℃放置，常温放置可以保持Rubisco活性）。
注：Rubisco样品提取液最好立即测定，不建议保存。
三、 Rubisco活性测定分析：
   1. 即用型酶溶解缓冲液配制：
      按照标签所示，在试剂10-酶溶解缓冲液原瓶中加入1.5 ml灭菌水和1 ml BSA溶液（50mg/ml），混匀后即配成即用型酶溶解缓冲液，冰浴备用，-20℃保存。
2. 试剂3-GAPDH和试剂5-CPK按照标签所示加入即用型酶溶解缓冲液，混匀溶解后冰浴备用，-20℃保存。
   3. 试剂4-PGK为硫酸铵悬浮液，4℃12000g离心5分钟，去除上清（小心去除，可以保留少许上清，不要吸弃沉淀），沉淀中按照标签所示加入即用型酶溶解缓冲液，混匀溶解后冰浴备用，-20℃保存。
4. 试剂9-RuBP：按照标签所示加入灭菌水，彻底混匀后冰浴备用。
注：RuBP溶液稳定性较差，用后-20℃保存，有效期3-4天，长期-80℃保存。
5. 试剂8-NADH：按照标签所示加入灭菌水，彻底混匀后冰浴备用。
注：NADH稳定性较差，用后-20℃贮存3-4天，长期-80℃保存。
6. 反应体系MasterMix配制：

加入顺序	组份	1ml反应体系加入量	MasterMix配制 （测定n个样品为例）
1	10×Assay Buffer	100 μl	n×100μl
2	灭菌水	795μl	n×795μl
3	ATP溶液（100×）	10 μl	n×10μl
4	CrP溶液（100×）	10 μl	n×10 μl
5	GAPDH溶液（200×）	5 μl	n×5 μl
6	PGK溶液（100×）	10 μl	n×10 μl
7	CPK溶液（100×）	10 μl	n×10 μl
8	NADH溶液（100×）	10 μl	n×10 μl

7. 反应体系测定；
1.5 ml离心管中配制以下反应。

	1	2	3
	对照反应	初始活性测定	总活性测定
MasterMix	950 μl	950 μl	950 μl
即用型Rubisco提取缓冲液 （步骤一）	25 μl	-	-
Rubisco样品提取液 （步骤二）	-	25μl	25μl 常温放置15分钟
试剂9-RuBP溶液	25 μl	25 μl	25μl
		加入RuBP后立即测定OD340读数，记录60秒内OD340值变化。

注：一般分光光度计OD₃₄₀读数在0.5-3之间数据比较准确，低于此范围说明提取用的材料太少，Rubisco活性太低；高于此范围说明所用材料太多，Rubisco活性太高，此时可以将Rubisco样品提取液用即用型Rubisco提取缓冲液稀释后测定。
四、Rubisco活性计算：
根据如下公式计算样品中Rubisco活初始性和总活性：

Activity（μmol·m^-2·S^-1）-表示每秒每平方米叶片有多少μmol NADH被氧化
△A-反应最初1分钟内340nm处测定管吸光度变化的绝对值
N-稀释倍数，本程序中为40（1 ml提取液，取25μl测定）。
6.22-每微摩尔NADH在340nm处的吸光系数
d-cm 比色皿光程，一般为1
△t-秒 测定时间，本程序为60秒
S-cm² 提取时使用的叶面积