生物样本分析：去除脂溶性维生素的血清及血浆

Keywords：Free fat soluble vitamins; Serum; Plasma; In Vitro Diagnostics; IVD
体外诊断（In Vitro Diagnostics, IVD）是一种医疗检测方法，广泛应用于各种疾病的预防、诊断、疗效观察等方面，对于提高诊断的准确性、治疗的有效性等情况，具有积极的意义。它通过分析人体的体液、细胞或组织样本，为医生提供了宝贵的诊断信息，进而辅助制定治疗计划。为确保检验结果的准确性和可靠性，合适的样本选择至关重要！

血液类样本作为体外诊断最主要的样本类型之一，因其组分的不同可以做不同的项目，然而，在临床诊断中研究者发现在一些疾病诊断中，血清（Serum）或血浆（Plasma）中的脂溶性维生素（Fat Soluble Vitamins）的含量会干扰对其他指标的判断。因此，为了准确测定其他物质的含量或指标的变化，需将血清或血浆中的脂溶性维生素去除。

一、基本定义
脂溶性维生素(Fat Soluble Vitamins)是不溶于水而溶于脂肪及非极性有机溶剂(如苯、乙醚及氯仿等)的一类维生素，包括维生素A、维生素D、维生素E、维生素K。这类维生素一般只含有碳、氢、氧三种元素，在食物中多与脂质共存，其在机体内的吸收通常与肠道中的脂质密切相关，可随脂质吸收进入人体并在体内储存(主要在肝脏)，排泄率不高；摄入量过多易引起中毒现象，若摄入量过少则缓慢出现缺乏症状。另外，脂溶性维生素大多稳定性较强。下表为4种脂溶性维生素主要作用。

种类	作用
维生素A	1.增强视网膜感光力参与视紫红质的合成，缺乏时视紫红质合成减少，对弱光敏感性降低，在弱光下视物模糊，称为夜盲症； 2.维持上皮组织结构的完整性和功能参与糖蛋白合成，缺乏时可引起上皮干燥、增生及角化，如皮脂腺角化，出现丘疹；泪腺细胞角化，泪液分泌减少，眼部干燥，称为眼干燥症； 3.促进机体正常生长发育促进骨细胞的分化，维持成骨细胞及破骨细胞之间的平衡；促进蛋白质、黏多糖及类固醇的合成，缺乏时组织生长发育不良； 4.促进吞噬细胞和淋巴细胞的功能，促进细胞因子的释放，增强机体免疫力；有效抑制氧自由基的活性，保护细胞免受伤害，具有一定的癌症预防作用。
维生素D	1.促进钙、磷在小肠和肾小管的吸收，维持正常稳定的血钙和血磷浓度； 2.在甲状旁腺素和降钙素的协同下，促进骨钙入血，维持血钙和血磷的平衡； 3.促使钙沉着于新骨形成部位，促进生长和骨骼钙化，促进牙齿健。
维生素E	1.抗氧化作用能抑制不饱和脂肪酸的氧化，减少过氧化脂质的形成以及对机体生物膜的损害，有抗衰老、抗癌及防止动脉粥样硬化作用； 2.维持和促进生殖功能使促性腺激素分泌增加，促进精子生成和运动，增加卵泡生长和孕酮的分泌； 3.参与多种酶活动增强微粒体中混合功能氧化酶的活性，抑制脱氧核糖核酸等分解酶系统，并对含巯基酶有保护作用； 4.其他维持毛细血管的正常通透性，增加血流量，修复血管壁损伤后的瘢痕，抑制血小板聚集，防止血栓形成；维持骨骼肌、心肌和平滑肌的正常结构和功能。
维生素K	1.可以促进肝脏合成四种凝血因子，凝血酶原、转变加速因子，抗血友病因子，促进血液凝固； 2.可增强肠蠕动和分泌功能，延缓糖皮质激素在肝内分解，并有类似氢化可的松的作用，长期注射维生素K可增强甲状腺的内分泌活性等； 3.可以舒张内脏平滑肌，缓解肾绞痛、胆绞痛、泌尿系出血，临床上常用其注射剂治疗血尿、尿结石、胆结石发作时，能解痉镇痛。

由上可知，脂溶性维生素主要储存于肝脏组织中，但在个体其余组织或体液中也均有存在，包括作为体外诊断主要样本类型之一的血液样本。血液样本包含全血、血清和血浆三种类型，其中全血由血细胞和血浆组成，应用于临床血液学检查，如红细胞计数、分类和形态学检查等；血浆是血液加入抗凝剂后，经离心分离得到的液体，含有纤维蛋白原、白蛋白、球蛋白以及各种凝血因子，这些成分共同维持着血液的凝固功能；而血清则是血液在体外自然凝固或加促凝剂后分离出的淡黄色透明液体，它主要含有白蛋白、球蛋白及各种无机离子。



血清或血浆中的生理成分与机体组织间液比较接近，更能真实地反应机体的生理情况，反应其病理改变也更加灵敏。因此，在某些疾病诊断中，为避免脂溶性维生素对于特定疾病或研究的影响，合理的去除血清或血浆中的脂溶性维生素显得尤为重要！

二、去除脂溶性维生素的方法
由上可知，在一些特殊情况下，需采用合理的方法将血清或血浆中的脂溶性维生素去除，本文以去除维生素D为例，简要的描述4种从血清或血浆中去除维生素D的工艺，仅供参考。

工艺	方法	优缺点
有机溶剂提取法	取一定量的血浆或血清样本，加入适量的乙酸乙酯或氯仿，震荡，使有机溶剂与维生素D充分混合，离心即可得到不含维生素D的血浆或血清	优点：操作简单：步骤较少，易于实施。 成本低：所需试剂和设备较为常见。 缺点：选择性差：可能同时提取其他脂溶性物质。 溶剂残留：可能影响后续实验。
透析法	使用特定孔径的透析膜，置于缓冲液中，维生素D无法通过微孔膜，遂去除	优点：温和，不破坏样品中的蛋白质和其他大分子； 操作简单，无需复杂设备。 缺点：耗时长，通常需要数小时至数天； 效率低：对小分子去除效果有限。
固相萃取（SPF）法	使用C18或其它反相柱，先吸附基质中的脂溶性成分，而后用有机溶剂洗脱	优点：选择型好，能有效分离脂溶性物质； 样品损失少：回收率较高。 缺点：操作复杂，步骤较多，需优化条件； 成本较高，固相萃取柱价格较贵。
色谱法	使用高效液相色谱（HPLC）或气相色谱（GC）分离并去除维生素D	优点：高分离度，能精确分离复杂样品中的特定成分； 灵敏度高，适合微量分析。 缺点：设备昂贵，需用专业仪器； 操作复杂，需专业人员操作。
免疫吸附法	使用抗维生素D的抗体，通过免疫吸附去除基质中的维生素D	优点：特异性强，抗体能特异性结合维生素D； 高效，去除效果显著。 缺点：成本高，抗体价格昂贵； 操作复杂，需优化实验条件。
物理吸附法	先用水解试剂使与蛋白质结合的维生素D分离，使其游离，再利用活性炭等物理方法进行吸附去除	优点：操作简单，成本较低，无化学污染，广谱吸附性，可调节性强。 缺点：受环境影响较大，吸附选择性差。

综上所述，不同方法具有各自的优缺点，IPHASE结合实际，选用物理吸附法去除维生素D，并使用LC-MS/MS进行验证，结果如下。图1为IPHASE技术人员定量本司维生素D质谱检测下限为0.5ng/ml，并以此为检测标准，测得图2实际产品图谱，图片显示IPHASE此次分离去除维生素D的空白生物基质其VD含量小于0.5ng/ml，因此，可证明IPHASE技术人员已成功去除血清中的维生素D，该产品符合要求。