创新高阶多重数字PCR技术应用：临床乳腺癌ERBB2基因突变液体活检
导读
在转移性乳腺癌（MBC）患者的临床管理中，精确评估肿瘤的分子特征至关重要，尤其是在预测治疗反应和监测耐药性方面。ERBB2（或HER2）基因的扩增或突变在乳腺癌的发病机制中起着重要作用，约20%的乳腺癌患者具有ERBB2的过表达或扩增。这类患者通常表现出较为侵袭性的疾病，并且对抗HER2的靶向治疗（如曲妥珠单抗、帕妥珠单抗）具有良好的反应。然而，随着治疗的进行，部分患者可能会出现耐药性，尤其是在疾病转移阶段，HER2的基因突变或扩增状态可能发生变化，导致疗效下降。
传统ERBB2的检测方法主要包括免疫组化、荧光原位杂交和基因扩增分析（如PCR）。这些方法通常基于肿瘤组织样本，但在转移性乳腺癌中，获取可用于检测的组织样本往往较为困难，且侵入性较大。与此同时，肿瘤的异质性也可能导致在不同病灶间ERBB2状态的差异，从而影响检测结果的可靠性。
法国雷恩尤金马奎斯中心在Molecular Oncology发表了题为"Plasma-based analysis of ERBB2 mutational status by multiplex digital PCR in a large series of patients with metastatic breast cancer "的文章。该研究聚焦于利用数字PCR技术检测转移性乳腺癌患者血浆中的ERBB2基因突变状态。作者探讨了通过血浆中的cfDNA检测ERBB2突变状态，作为一种非侵入性且可靠的检测方法的可能性。
应用亮点：
• 通过多重数字PCR（mdPCR）技术分析血浆样本中的ERBB2突变状态，能够高精度地检测到低频突变，在cfDNA检测中且具有非常高的灵敏度和特异性。
• 通过大量患者样本检测，展示了该技术在不同临床背景下广泛适用性和稳定性，提高了研究结果的可靠性。
实验结果：
1、多重筛查检测方案的设计和优化
研究者设计开发了一个ERBB2 (S) assay，能够单孔检测17种不同的ERBB2突变，方案见下图：
(A)ERBB2(S) assay的设计,使用四对引物（灰色箭头）同时扩增四个片段。FAM标记探针（蓝色）检测S310F和S310Y突变；HEX标记探针（绿色）检测D765S、D769H、D769Y、Y772_A775dup、G778_P780dup和L869R突变；FAM标记的降落探针（蓝色）+ Cy5标记的参考探针（红色）检测776-779位点的突变。
(B) 三色检测策略在772-780扩增子上的不同扩增情况。野生型序列：drop-off探针和参考探针都检测到，产生FAM+Cy5双阳性信号（case1）。776-779位点突变：仅检测到参考探针，产生Cy5单阳性信号（case2）。772_A775dup或G778_P780dup突变: HEX探针和参考探针都检测到，产生HEX+Cy5双阳性信号（case3）。Y772_A775dup突变（case4）、G778_P780dup突变（case5）或两者同时存在（case6）会产生FAM+HEX+Cy5+三阳性信号。
该方案中研究者通过不同的荧光信号组合来识别特定的ERBB2突变，为临床提供精确的基因突变信息。这种多重检测方法的优势在于能够在同一反应中检测多种突变，提升检测效率并降低成本。
2、ERBB2 (S) 检测的优化及验证
每个荧光通道阴阳性微滴的荧光阈值设置如下图所示。设置阈值时，应将阳性和阴性对照的点图与样本的点图一起合并分析。确保在阈值设置后，阳性对照中的阳性微滴可以被正确统计。
使用系列稀释的MUT gBlocks (设计合成特定的ERBB2基因突变位点，作为数字PCR检测方法的阳性对照)在恒定的WT gDNA背景中进行敏感性测试，结果表明检测的敏感性分别为S310F/Y为0.25%，L755S-D769H/Y-L869R为0.27%，Y772_A775dup-G778_P780dup为0.18%，776-779MUT为0.10%。
(A)ERBB2(S)Assay：1D图(左)：显示了每个探针在单重反应中产生的优化荧光信号。2D图(中)：展示了通过混合野生型gDNA和突变gBlocks定义的多边形阈值策略。3D图(右)：根据相对的FAM-HEX-Cy5荧光信号显示簇的位置。
(B)六种野生型-突变双重检测定义的多边形阈值的策略。
线性研究验证了在5到1000 copies/PCR动态范围内的准确性，线性回归分析的R2值在0.9948到0.9999之间。
研究还评估了检测的重复性和再现性，CV值在3.4%到12.5%之间，满足数字PCR验证实验中CV值小于20%的接受标准。
3、ERBB2突变的诊断策略
研究者开发了一个临床两步诊断策略（见下图）：首先进行初步的筛查，如果结果为阳性（即发现ERBB2基因的突变），则进行第二步的WT-MUT Duplex检测以精确识别突变类型。
4、患者样本的ERBB2突变检测结果
在272名HR+/HER2MBC患者的304份血浆样本中，有9名患者（3.3%）至少携带一种ERBB2突变。突变样本的cfDNA浓度和突变等位基因频率（MAF）在不同患者中分布广泛。
在9名突变患者中，有3名患者同时检测到两种ERBB2突变，这可能是由于检测的高灵敏度，能够检测到低至0.06%的低频突变。对其中两名患者进行了ERBB2突变水平的纵向随访，发现突变浓度的变化与疾病进展和治疗反应相关。
在6名患者的匹配肿瘤样本中，有5名患者的ERBB2突变在血浆cfDNA和肿瘤组织之间具有一致性。
结论：
多重数字PCR技术可以有效地检测ERBB2突变状态，并在晚期转移性乳腺癌患者中具有潜在的临床应用价值。通过血浆样本检测ERBB2突变，不仅提供了对肿瘤基因组状态的实时监测，而且能够为个体化治疗提供重要信息，为患者靶向治疗的决策提供依据。数字PCR用于非侵入性检测方法的开发平台，有望成为未来乳腺癌分子诊断和监测的重要工具。
参考文献：
Corné J, Quillien V, Godey F, et al. Plasma-based analysis of ERBB2 mutational status by multiplex digital PCR in a large series of patients with metastatic breast cancer. Mol Oncol. 2024; ahead of print. doi:10.1002/1878-0261.13592.
实体瘤突变检测可用于患者全病程管理（基因分型、靶向药检测、疗效和预后评估、复发监测），艾普拜生物已开发测试针对多种样本类型（体液、新鲜冰冻组织、FFPE）的常见突变数字PCR检测试剂盒，详情见下表。
