六重数字PCR检测方法助力转基因快速、准确、精准定量检测

在当前全球化市场下，转基因生物（GMO）的多样性和复杂性不断增加，对GMO检测实验室和政策制定者提出了许多新的挑战。传统的qPCR技术在单次检测中对GMO数量的限制使其在成本和效率存在局限性。为了解决这些问题，斯洛文尼亚国家生物研究所在foods发表了题为“ Fast and Accurate Multiplex Identification and Quantification of Seven Genetically Modified Soybean Lines Using SixColor Digital PCR ”的文章。本研究开发了一种创新的六色数字PCR技术，通过单一检测实现对多个转基因靶标的同时定量。

 文献解读：

本研究探索了六重检测中量化五种转基因大豆转化体的能力，也探索了两个四重检测量化七种转基因大豆转化体的灵活性，实验结果展示了该方法具备高度特异性、灵敏度和精确度。

本文遵循dMIQE2020的要求进行实验，确保实验的质量和结果的可靠性。

 应用亮点：

▶ 开发了六重数字PCR检测方法，对五种转基因大豆转化体及大豆参考基因lectin(Le1)同时量化。

▶ 使用真实样本验证了该方法在复杂样品中量化转基因大豆转化体的适用性。

▶ 与传统的qPCR相比，该多重dPCR方法显著节约时间和成本，提高检测的效率。

该研究从转基因大豆CRM中提取DNA。非盲样本包括两种DNA混合物，分别对应六重检测的五种转基因大豆转化体和四重检测的七种转化体，用于检测方法的特异性研究。盲样样本选择了四个来自常规研究的样本，用于检测方法适用性研究。

 实验结果：

1、特异性：

在非目标材料中没有观察到交叉反应，表明检测方法能够有效区分目标转基因转化体。

2、检测限（LOD）和定量限（LOQ）：

LOD≤25拷贝/反应，LOQ≤50拷贝/反应或以下，部分靶标低至12拷贝/反应。

3、线性：

即使是在极低浓度下，所有靶标检测均显示出极佳的线性拟合度。

图1. 6-plex检测每个目的基因的线性。右下角显示了R2值。X轴为每个反应的估计拷贝数，Y轴为每个反应的检测的拷贝数。

图4. 4-plex检测每个目的基因的线性。右下角显示了R2值。X轴为每个反应的估计拷贝数，Y轴为每个反应的检测的拷贝数。

4、数据分析优化：

研究采用了两种数据分析优化方法。

①. 通过空白限（LOB）校正，可以提高LOQ和LOD精确度。

②. 反应的合并孔分析，进一步降低了LOD，提高了检测灵敏度。

5、方法适用性：

使用真实样本进行测试，多重数字PCR检测方法适用于量化复杂样本中的低浓度转基因成分。证明了dPCR方法在量化复杂样品中低GMO含量方面的适用性。

结论：

本研究展示了GMO多重数字PCR检测方法中极具应用潜力和适用性，特别是在复杂样品和低靶标浓度检测时，该方法依旧展示出极高的特异性、灵敏度和精确度，为在复杂样品中全面分析GMO成分，提供了新思路和新方法。文中同时强调，在当下转基因产品日益多样化的趋势下，采用创新技术进行有效地和高通量GMO检测方法非常重要。

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