创新高阶多重数字PCR快速检测PIK3CA热点突变的方法

导读 
PIK3CA基因编码的p110α是磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）的催化亚基，在细胞的生长、增殖、凋亡和代谢等过程中发挥重要的调节作用。肿瘤基础科研和临床研究发现，PIK3CA基因的突变会导致PI3K信号通路异常激活，促进肿瘤的发生发展。因此，检测PIK3CA基因的突变对于肿瘤的诊断、预后评估和治疗具有重要意义。

PIK3CA突变通常为体细胞突变仅发生在肿瘤细胞中，并且一般是低频突变，传统的检测方法，如qPCR、Sanger测序、NGS等，存在灵敏度不足、操作复杂和高成本等缺点。此外，现有检测方法通常无法实现高通量、多位点的同时检测，限制了其临床应用。

近日，荷兰鹿特丹大学医学中心在The Journal of Applied Laboratory Medicine上发表了题为"A Multiplex Assay for Fast PIK3CA Hotspot Mutation Characterization in a Singe Specimen by 3-Color Digital PCR Analysis" 的文章，该研究开发了一种高阶多重数字PCR（dPCR）检测方法，实现了单孔对单个样本中4种PIK3CA热点突变的经济快速精准检测。

 研究亮点：
• 通过3色数字PCR平台可以在单个反应中同时检测4种PIK3CA热点突变。

• 变异等位基因频率（VAF）的检测下限低至0.003%，适用于液体活检和肿瘤组织样本。

• 与现有的单重dPCR检测和NGS分析相比，该方法成本更低，且所需的cfDNA量更低。

 实验结果：
作者设计一种多重dPCR检测方法，用于同时评估PIK3CA基因中最常见的4种热点突变：exon 9的p.E542K和p.E545K突变，以及exon 20的p.H1047L和p.H1047R突变。该方法还包括了一个exon 20区域的内参探针，用于计算4种突变的变异等位基因频率（VAFs）。

利用 Naica Prism软件生成的散点图，显示了 PIK3CA 突变及参考基因的微滴分布。通过dPCR，可以在(图A)二维图中同时评估不同的突变，这些突变在特定的相对荧光强度（RFU）内形成明显的聚集(图B)。在二维图 C, D 中，参考基因可以通过绿-蓝(C) 或绿-红(D) 图进行计数，所有RFU高于 22K的点。p.H1047R 和 p.E545K 突变的微滴位于蓝色轴 (C) 的 25 到 30 K 和 35 到 40 K RFU 范围内，而 p.E542K 和 p.H1047L 突变的微滴分布在红色轴 (D) 的 40 到 50 K 和 35 到 40 K RFU 范围内。

作者比较了商业单重检测试剂盒和多重 dPCR 检测方法，分析了具有理论 VAF 为 15% 的样本（原始样本，下图A左）和预扩增后的样本（预扩增样本，下图A右）。单重和多重检测的结果分别用浅色和深色显示。对于 p.E542K（P = 0.12, P = 0.23）、p.E545K（P = 0.13, P = 0.60） 和 p.H1047L（P = 0.38, P = 0.82）突变，单重与多重检测方法在原始和预扩增样本中分析的 VAF 无显著差异。但在单重检测中，预扩增样本的 p.H1047R 测得的 VAF 低于预期（P = 0.03），而多重检测方法在原始和预扩增样本中都准确地检测出预期的 VAF（P = 0.63）。

作者通过梯度稀释探索了多重dPCR检测方法对PIK3CA热点突变的检测限LOD（Limit of Detection）。下图B显示了在不同VAF稀释度（15%，1%，0.5%，和0.25%）下，对于每种突变（p.E542K、p.E545K、p.H1047L和p.H1047R）检测到的VAFs。多重检测方法可以检测到低至0.25% VAF的突变拷贝。

为了确定该方法的LOB (Limit of Blank)，作者通过20个来自健康志愿者的阴性对照cfDNA样本来确定突变拷贝浓度（拷贝数/µL）、突变拷贝总数以及VAF的最小阈值。经过评估，在原始和预扩增样本中只有VAF大于等于0.003%和0.68%的样本被视为真正阳性（见下表）。

作者使用经NGS检测PIK3CA突变阳性的96名乳腺癌患者的预扩增cfDNA样本进行多重dPCR评估，并将结果与之前NGS的结果进行比较。在不使用和使用LOB的情况分别在96个（100%）和82个（85%）cfDNA中确认了突变。此外，预扩增cfDNA中通过dPCR检测的VAF与NGS检测的原始cfDNA中的VAFs高度相关（下图A，Rp>0.79，P<0.001）。使用经NGS检测PIK3CA突变阴性的12名乳腺癌患者的预扩增cfDNA样本进行了多重dPCR评估，设置LOB后可以将11名患者判定为阴性，在患者4原始样本中检测到了带有p.H1047R突变的cfDNA（下图B）。

(A)使用多重dPCR检测对NGS检测PIK3CA突变阳性的96名患者乳腺癌cfDNA中的4种突变进行了评估。图中显示了通过NGS和dPCR检测的VAF，其结果具有良好的相关性。(B)使用多重dPCR检测对NGS检测PIK3CA为野生型的12名患者原始和预扩增cfDNA进行多重dPCR检测评估。

 结论：

作者开发了一种基于三色数字PCR的多重检测方法，能够快速、准确地同时检测 PIK3CA 基因的 4种常见热点突变。通过与NGS结果的比较，验证了该检测方法在临床样本中的诊断准确性，展示了其在癌症基因检测领域的巨大潜力。相比传统的单重检测方法，多重数字PCR方法显著降低了检测成本，提升了检测效率，保证了灵敏度和准确性。未来，该技术有望广泛应用于肿瘤诊断、治疗指导以及其他遗传突变相关的研究和临床应用中，为个性化精准医学发展提供强有力的技术支持。

参考文献：

Helmijr, Jean, et al. "A Multiplex Assay for Fast PIK3CA Hotspot Mutation Characterization in a Single Specimen by 3-Color Digital PCR Analysis." Journal of Applied Laboratory Medicine, vol. 9, no. 5, Sept. 2024, pp. 913–925. https://doi.org/10.1093/jalm/jfae064.

实体瘤突变检测可用于患者全病程管理（基因分型、靶向药检测、疗效和预后评估、复发监测），艾普拜生物已开发测试针对多种样本类型（体液、新鲜冰冻组织、FFPE）的常见突变数字PCR检测试剂盒，详情见下表。另有多款数字PCR试剂盒可用于血液肿瘤全病程管理和病原微生物检测。欢迎咨询和订购。