靶基因甲基化测序(Target-BS)等在揭示特应性皮炎新发现中的应用
特应性皮炎（atopic dermatitis，AD）是一种常见的炎症性皮肤疾病，特征为剧烈瘙痒、复发性湿疹样病变和Th2介导的免疫反应。调节性T细胞（Regulatory T cell，Treg）在调控炎症、抑制Th2细胞(T helper 2 cell)和维持免疫稳态中发挥关键作用。先前的研究对于AD患者中Treg比例存在冲突结果，一些研究发现Treg比例未改变，而其他研究则报告Treg数量增加。在过敏性疾病中，Treg对Th2细胞的抑制作用被破坏以及Th2型炎症的促进背后的精确分子机制尚不清楚。因此，探究AD中Treg数量和功能变化背后的分子机制至关重要。
近日，南方医科大学皮肤病医院梁云生课题组探讨了在特应性皮炎（AD）中，Treg数量和功能变化的分子机制，以及这些变化如何影响Th2型炎症。相关研究成果以“IL-4-induced decrease in both the number and CTLA-4 expression of Treg impairs suppression of Th2 type inflammation in severe atopic dermatitis”为题发表在《Journal of Dermatological Science》期刊。
研究通过流式细胞术、mRNA测序（mRNA-seq）、共培养实验、共免疫沉淀、染色质免疫沉淀和亚硫酸盐测序（BS-seq）等方法，在体外或AD小鼠模型以及AD患者中研究分子机制。分析结果表明在轻度和中度AD中检测到Treg比例增加。而在重度AD患者中，Treg数量和CTLA-4表达特征性减少则与血清IL-4 (interleukin-4)水平相关，这与体外高浓度IL-4处理下的验证分析结果一致。其背后机制是IL-4/pSTAT6通路招募DNMT1和HDAC2来抑制Foxp3和CTLA-4位点的转录调控。高水平的IL-4破坏了Treg通过CTLA-4介导的Th2细胞分化抑制，而在Treg中阻断IL-4Rα信号恢复了AD模型小鼠和AD患者的Treg数量和Th2细胞抑制。
总之，本研究结果表明，Treg数量及AD患者严重程度分级与血清IL-4水平相关。异常高水平IL-4表观遗传调控Treg数量和CTLA-4表达减少。IL-4诱导Treg上的CTLA-4表达减少损害了Th2细胞分化抑制。
研究方法
结果图形
（1）Treg数量与AD严重程度分级和血清中IL-4水平相关。IL-4导致重度AD患者的Treg数量和CTLA-4表达减少。
B. AD患者和HVs的血清IL-4水平。
C. 重度AD患者和年龄性别匹配的健康志愿者外周血中CTLA-4+表达（在CD3+ CD4+ Foxp3+ CD25+ Treg中筛选）的代表性流式细胞术和定量分析。
D. AD患者中Foxp3+、CTLA-4+表达与血清IL-4水平之间的相关性。
E. 培养的Treg中Foxp3+ CD25+ Treg（在CD4+ T细胞中筛选）、CTLA-4+表达（在CD4+ T细胞中筛选）的代表性流式细胞术和定量分析。
（2）IL-4/pSTAT6信号通路如何通过招募DNA甲基转移酶1（DNMT1）和组蛋白去乙酰化酶2（HDAC2）来抑制Foxp3和CTLA-4基因位点的转录调控。
图2. IL-4/pSTAT6通路招募DNMT1和HDAC2来抑制Foxp3和CTLA-4位点的转录调控。从健康志愿者（HV）的外周血单个核细胞（PBMCs）中纯化出初始T细胞，并在体外用IL-2/TGFβ1培养4天，然后有或没有高浓度IL-4刺激额外3天。
A. 聚类热图显示培养的Treg中转录因子差异表达，其中深红色表示高基因表达水平。
B. Western blotting分析TETs、DNMTs和HDACs蛋白。
C. Target-BS分析Foxp3和CTLA-4位点的CpG DNA甲基化，以分析IL-4处理/未处理组Treg的甲基化状态。图表显示通过亚硫酸盐测序鉴定的DNA甲基化数量。
D. 收集Treg细胞、裂解，并用抗pSTAT6抗体免疫沉淀（IP）。通过免疫印迹法分析IP蛋白，使用抗DNMTs或抗pSTAT6抗体。
E. 使用抗DNMT1和抗pSTAT6抗体进行ChIP实验。通过实时PCR检测Foxp3启动子和CNS2的免疫沉淀DNA的相对量，并相对于IgG进行归一化。
F. Treg被转染HDAC2 siRNA或对照siRNA，并在体外用IL-2/TGFβ1培养4天，然后有或没有高浓度IL-4刺激额外3天。代表性的流式细胞术和定量分析Foxp3+和CTLA-4+表达。
G. 使用抗HDAC2和抗pSTAT6抗体进行ChIP实验。通过实时PCR检测Foxp3和CTLA-4启动子的免疫沉淀DNA的相对量，并相对于IgG进行归一化。每组n=3，三个重复。
（3）高水平IL-4破坏了CTLA-4介导的Treg对Th2细胞分化的抑制作用。
B. Teffs中IL-4表达的代表性流式细胞术和定量分析。每组n=3，三个重复。
（4）IL-4在AD小鼠模型中破坏了Treg对Th2型炎症的抑制作用。
B-C. 第16天从整个耳朵和血液中IL-4+表达的代表性流式细胞术和定量分析。
D-E. 第16天从整个耳朵和血液中Foxp3+ CD25+ Treg和CTLA-4+表达的代表性流式细胞术和定量分析。每组n=3只小鼠，三个重复。
（5）达必妥(Dupilumab) 恢复了重度AD患者的Treg数量和CTLA-4表达，并抑制Th2型炎症。
图5. Dupilumab恢复了重度AD患者的Treg数量和CTLA-4表达及其对Th2炎症的抑制作用。
A. 在不同时间点对AD患者外周血中Foxp3+ CD25+ Treg的代表性流式细胞术和定量分析。
B. CTLA-4+ Foxp3+ Treg的代表性流式细胞术和定量分析。
C. 在不同时间点对Th2细胞的代表性流式细胞术和定量分析。
易小结
参考文献：
Wang B, Yu Z, Liu J, Tian Y, Ruan Y, Kong T, Hou M, Yu B, Ling S, Wang D, Chen Y, Xu Y, Deng W, Liang Y. IL-4-induced decrease in both the number and CTLA-4 expression of Treg impairs suppression of Th2 type inflammation in severe atopic dermatitis. J Dermatol Sci. 2024 Mar 23. pii: S0923-1811(24)00053-7. doi: 10.1016/j.jdermsci.2024.03.007. PubMed PMID: 38556434.
近日，南方医科大学皮肤病医院梁云生课题组探讨了在特应性皮炎（AD）中，Treg数量和功能变化的分子机制，以及这些变化如何影响Th2型炎症。相关研究成果以“IL-4-induced decrease in both the number and CTLA-4 expression of Treg impairs suppression of Th2 type inflammation in severe atopic dermatitis”为题发表在《Journal of Dermatological Science》期刊。
研究通过流式细胞术、mRNA测序（mRNA-seq）、共培养实验、共免疫沉淀、染色质免疫沉淀和亚硫酸盐测序（BS-seq）等方法，在体外或AD小鼠模型以及AD患者中研究分子机制。分析结果表明在轻度和中度AD中检测到Treg比例增加。而在重度AD患者中，Treg数量和CTLA-4表达特征性减少则与血清IL-4 (interleukin-4)水平相关，这与体外高浓度IL-4处理下的验证分析结果一致。其背后机制是IL-4/pSTAT6通路招募DNMT1和HDAC2来抑制Foxp3和CTLA-4位点的转录调控。高水平的IL-4破坏了Treg通过CTLA-4介导的Th2细胞分化抑制，而在Treg中阻断IL-4Rα信号恢复了AD模型小鼠和AD患者的Treg数量和Th2细胞抑制。
总之，本研究结果表明，Treg数量及AD患者严重程度分级与血清IL-4水平相关。异常高水平IL-4表观遗传调控Treg数量和CTLA-4表达减少。IL-4诱导Treg上的CTLA-4表达减少损害了Th2细胞分化抑制。
研究方法
- 研究队列：42名AD患者和14名健康志愿者（(healthy volunteers，HVs），以及用于实验的特定基因敲除小鼠。
- 通过MC903诱导AD小鼠模型，评估耳厚度和组织学变化。
- 从人和小鼠样本中分离和分化细胞，进行Treg抑制实验和流式细胞术分析。
- 使用ELISA和Western blotting技术分析血清和蛋白表达水平。
- 通过亚硫酸盐测序（Target-BS）和共免疫沉淀实验分析DNA甲基化和蛋白相互作用。
- 进行染色质免疫沉淀（ChIP）和RT-qPCR分析特定基因位点的表观遗传修饰。
结果图形
（1）Treg数量与AD严重程度分级和血清中IL-4水平相关。IL-4导致重度AD患者的Treg数量和CTLA-4表达减少。
图1. IL-4水平增加导致重度AD患者中Treg数量和CTLA-4表达减少。
A. AD患者和健康志愿者（HVs）中Foxp3+ CD25+ Treg（在CD3+ CD4+ T细胞中筛选）的代表性流式细胞术和定量分析。B. AD患者和HVs的血清IL-4水平。
C. 重度AD患者和年龄性别匹配的健康志愿者外周血中CTLA-4+表达（在CD3+ CD4+ Foxp3+ CD25+ Treg中筛选）的代表性流式细胞术和定量分析。
D. AD患者中Foxp3+、CTLA-4+表达与血清IL-4水平之间的相关性。
E. 培养的Treg中Foxp3+ CD25+ Treg（在CD4+ T细胞中筛选）、CTLA-4+表达（在CD4+ T细胞中筛选）的代表性流式细胞术和定量分析。
（2）IL-4/pSTAT6信号通路如何通过招募DNA甲基转移酶1（DNMT1）和组蛋白去乙酰化酶2（HDAC2）来抑制Foxp3和CTLA-4基因位点的转录调控。
A. 聚类热图显示培养的Treg中转录因子差异表达，其中深红色表示高基因表达水平。
B. Western blotting分析TETs、DNMTs和HDACs蛋白。
C. Target-BS分析Foxp3和CTLA-4位点的CpG DNA甲基化，以分析IL-4处理/未处理组Treg的甲基化状态。图表显示通过亚硫酸盐测序鉴定的DNA甲基化数量。
D. 收集Treg细胞、裂解，并用抗pSTAT6抗体免疫沉淀（IP）。通过免疫印迹法分析IP蛋白，使用抗DNMTs或抗pSTAT6抗体。
E. 使用抗DNMT1和抗pSTAT6抗体进行ChIP实验。通过实时PCR检测Foxp3启动子和CNS2的免疫沉淀DNA的相对量，并相对于IgG进行归一化。
F. Treg被转染HDAC2 siRNA或对照siRNA，并在体外用IL-2/TGFβ1培养4天，然后有或没有高浓度IL-4刺激额外3天。代表性的流式细胞术和定量分析Foxp3+和CTLA-4+表达。
G. 使用抗HDAC2和抗pSTAT6抗体进行ChIP实验。通过实时PCR检测Foxp3和CTLA-4启动子的免疫沉淀DNA的相对量，并相对于IgG进行归一化。每组n=3，三个重复。
（3）高水平IL-4破坏了CTLA-4介导的Treg对Th2细胞分化的抑制作用。
图3. 高水平IL-4破坏了CTLA-4介导的Treg对Th2细胞分化的抑制作用，OTII小鼠脾脏中分离的CTV标记的CD4+ CD25− Teffs和从BMDCs衍生的DCs与Foxp3YFP/Cre或Il4rafl/fl Tregs以1:1:1的比例共培养2天。
A. CTV标记的Teffs数量和定量。B. Teffs中IL-4表达的代表性流式细胞术和定量分析。每组n=3，三个重复。
（4）IL-4在AD小鼠模型中破坏了Treg对Th2型炎症的抑制作用。
图4. IL-4破坏了AD小鼠模型中Treg对Th2型炎症的抑制作用。
A. 第16天用乙醇（EtOH）或MC903处理的小鼠耳朵的代表性图像和组织学H&E染色结果。B-C. 第16天从整个耳朵和血液中IL-4+表达的代表性流式细胞术和定量分析。
D-E. 第16天从整个耳朵和血液中Foxp3+ CD25+ Treg和CTLA-4+表达的代表性流式细胞术和定量分析。每组n=3只小鼠，三个重复。
（5）达必妥(Dupilumab) 恢复了重度AD患者的Treg数量和CTLA-4表达，并抑制Th2型炎症。
图5. Dupilumab恢复了重度AD患者的Treg数量和CTLA-4表达及其对Th2炎症的抑制作用。
B. CTLA-4+ Foxp3+ Treg的代表性流式细胞术和定量分析。
C. 在不同时间点对Th2细胞的代表性流式细胞术和定量分析。
易小结
- Treg数量和AD的严重程度分级与血清IL-4水平相关。
- 异常高水平的IL-4表观遗传调控Treg数量和CTLA-4表达减少。
- Treg中由IL-4诱导的CTLA-4表达减少破坏了Th2细胞分化抑制。
- 阻断Treg中的IL-4Rα信号可以恢复Treg数量和对Th2型炎症的抑制，为AD治疗提供了新的策略和深入的机制理论。
参考文献：
Wang B, Yu Z, Liu J, Tian Y, Ruan Y, Kong T, Hou M, Yu B, Ling S, Wang D, Chen Y, Xu Y, Deng W, Liang Y. IL-4-induced decrease in both the number and CTLA-4 expression of Treg impairs suppression of Th2 type inflammation in severe atopic dermatitis. J Dermatol Sci. 2024 Mar 23. pii: S0923-1811(24)00053-7. doi: 10.1016/j.jdermsci.2024.03.007. PubMed PMID: 38556434.
标签：
DNA甲基化
