创新高阶多重数字PCR技术助力乳腺癌ESR1突变临床精准检测
导读
乳腺癌是女性中最常见的癌症之一，其发病机制复杂，涉及多种基因突变和信号通路的改变。其中，ESR1突变是已知的乳腺癌激素治疗耐药的重要机制。检测ESR1突变状态有助于选择更合适的治疗方案。并且，针对ESR1突变的靶向治疗药物，如Elacestrant（ORSERDUTM），已被FDA和EMA批准用于治疗ESR1突变阳性，ER+、HER-晚期或转移性乳腺癌。综上所述，ESR1突变检测对于乳腺癌患者的治疗决策、预后评估以及个性化治疗策略的制定具有重要的临床意义。
近日，雅典大学和雅典大都会综合医院的研究人员在The Journal of Liquid Biopsy发表了题为Multiplex detection of ten ESR1 mutations and AKT1 E17K in breast cancer using digital PCR 的文章。该研究开发并评估了一种新型多重数字PCR检测方法（12plex ESR1-AKT 6 色 Crystal Digital PCR® assay）的性能，用于检测ER+乳腺癌患者的血浆cfDNA（cell free DNA）中的十种常见ESR1突变和AKT1 E17K突变。
研究亮点：
▶ 开发了一种新型的12plex ESR1-AKT 6 色 Crystal Digital PCR® 检测技术，能够同时检测10种ESR1突变和AKT1 E17K突变, 能够节省成本和样本量，同时提高了检测的效率。
▶ 该技术具有高灵敏度和高特异性的特点，可以在血浆cfDNA中检测低丰度的突变，这些突变与内分泌治疗的抵抗性有关。
▶ 该技术整个检测流程可以在3小时内完成，对于临床决策和治疗调整具有重要意义。
实验结果：
本研究针对十种乳腺癌中常见ESR1突变位点、AKT1 E17K突变和TSN内参基因的数字PCR多重检测方法。这些突变与乳腺癌内分泌治疗的进展和耐药性密切相关。每个突变位点设计相应的引物和探针，其中ESR1的十种突变、AKT1 E17K突变和TSN在同一反应体系中同时进行检测。通过不同的荧光标记区分不同的突变位点，使得每个突变位点的信号可以独立地进行定量检测。
▲ESR1-AKT 6 色 Crystal Digital PCR® assay：Crystal Miner（数据分析软件） 2D 点图上阳性和阴性群体位置示意图。
为了评估多重检测方法对ESR1和AKT1突变的检测灵敏度，作者按照临床和实验室标准研究所（CLSI）EP17-A2标准确定了空白值（LoB）和检测限（LoD），如下表所示。
该研究使用了来自9名接受激素治疗的ER+乳腺癌并已确诊转移患者在5年随访期间不同时间点采集的35份血浆cfDNA样本，以及10名健康捐献者的样本。这些样本之前曾使用ESR1-NAPA（Normalized Allelic Prevalence Analysis）检测法进行过ESR1突变的分析。
使用ESR1-AKT 6色Crystal Digital PCR® assay方法在这些样本中检测到的AKT1 E17K突变的突变等位基因频率（MAF%）范围为1.1%到37.0%，而ESR1 D538G突变的MAF%范围为1.6%到27.6%（见下表）。
作者进一步将多重ESR1-AKT 6色Crystal Digital PCR® assay的结果与ESR1 NAPA检测进行了比较（结果见下表）。基于Cohen's kappa系数（k）的直接比较显示，Crystal Digital PCR® assay和ESR1 NAPA在检测突变方面具有高度一致性。
结论：
通过Crystal Digital数字PCR技术，研究人员成功开发高效、创新的高阶多重检测乳腺癌ESR1相关突变的方法，为乳腺癌的ESR1突变检测提供了更精准的工具，也为个性化治疗提供了支持。随着数字PCR技术的进一步推广和应用，未来乳腺癌的早期筛查、精准诊断和个性化治疗将迈向新高度。
参考文献：
Smilkou, S., Ntzifa, A., Stergiopoulou, D., Georgoulias, V., & Lianidou, E. (2024). Multiplex detection of ten ESR1 mutations and AKT1 E17K in breast cancer using digital PCR. The Journal of Liquid Biopsy, 5, 100154. https://doi.org/10.1016/j.jlb.2024.100154
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