动态RNA甲基化修饰及其在哺乳动物发育和疾病中的调控作用
在已鉴定的170多种RNA核苷酸碱基的化学修饰中，RNA甲基化是存在于几乎所有类型RNA上的的主要表观转录修饰类型，并已被证明参与RNA代谢的整个过程，包括转录、 pre-mRNA可变剪切和成熟、mRNA出核、mRNA降解和稳定、mRNA翻译。由于高通量检测技术发展以及动态调控因子和识别蛋白的鉴定，RNA甲基化修饰在调控生物体正常发育以及RNA甲基化失调时各种疾病发生和发育异常的机制已越来越清晰。中国科学院北京基因组研究所(国家生物信息中心)杨运桂研究员团队以“Dynamic RNA methylation modifications and their regulatory role in mammalian development and diseases“为题发表综述文章，特别关注三种RNA甲基化：N6-甲基胞嘧啶（m6A）、5-甲基胞嘧啶（m5C）和N7-甲基腺苷（m7G），总结了这三种RNA修饰与其动态组装和去除、特定结合蛋白以及高通量检测技术发展相关元件。为全面理解其生物学意义，还概述了这三种mRNA甲基化修饰在配子发生、胚胎发育、免疫系统发育以及疾病和肿瘤进展中的基本机制和关键作用的最新知识。
mRNA的分布特征和调控元件
m6A
m6A是研究最广泛的RNA甲基化修饰类型，几乎存在于所有类型的RNA中，包括染色质相关新生pre-mRNA（chromatin-associated nascent pre-mRNA，caRNA）、成熟mRNA和非编码RNA（ncRNA）。约25%哺乳动物细胞mRNA含有m6A，每个转录本平均含有三个m6A残基。利用LC-MS/MS技术鉴定出人类mRNA中m6A/A占比约0.4%–1.79%。m6A主要位于内部mRNA中，特别是在靠近终止密码子和mRNA的3′UTRs区域。m6A的保守motif序列是RRACH（R=A/G，H=A/C/U）。m6A的分布特征表明m6A可能广泛参与mRNA代谢，如可变剪切、翻译等，从而在生理和病理过程中发挥重要作用。m6A甲基化形成由甲基转移酶（“writers”）催化，主要由METTL3、METTL14和WTAP组成，以及其他蛋白亚基，包括ZC3H13/Hakai/Virilizer、KIAA1429（VIRMA）、RBM15/15B。METTL16也是METTL同源家族蛋白之一，催化MAT2A mRNA和U6 snRNA上的m6A形成。同时m6A甲基基团能够被去甲基化酶（“erasers”）去除，主要包括FTO和ALKBH5家族成员。m6A修饰的RNA碱基位点被特定的结合蛋白（“readers”）识别以执行多样的生物学功能。迄今为止已鉴定的m6A readers包括YTH结构域蛋白（YTHDC1-2、YTHDF1-3）、核异质核糖核蛋白（HNRNPC、HNRNPA2B1）、类胰岛素生长因子2 mRNA结合蛋白（IGF2BP1-3）、真核起始因子3（eIF3）（表1）。
m5C
m5C是另一种常见且丰富的RNA修饰，存在于各种RNA中，包括mRNA、tRNA、rRNA和vtRNA。在人类和小鼠的mRNA中，m5C位于翻译起始位点（TSS）的下游区域，通过LC-MS/MS检测人类mRNA中m5C/C占比约为0.02%–0.09%。
与m6A类似，m5C修饰也由其“writers”和“erasers”动态调控。已经鉴定的几个m5C甲基转移酶（writers），包括NOL1/NOP2/SUN结构域家族成员（NSUN1-7）、DNA甲基转移酶同源物（DNMT2）和特异性tRNA甲基转移酶家族成员（TRDMT4A和TRDMT4B），其中NSUN2和NSUN6能够催化mRNA上m5C形成。Tet家族蛋白（TET1和TET2）不仅催化DNA上5mC到5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）的形成，还介导mRNA中m5C氧化。目前，有两种主要类型的mRNA m5C readers蛋白，其具有特殊的RNA结合域，以决定m5C修饰RNA分子的不同命运，包括RNA和出口因子结合蛋白2（ALYREF）和Y-box结合蛋白（YBX1和YBX2）（表1）。
m7G
m7G也是一种普遍存在的RNA甲基化修饰，被发现位于真核生物的18S rRNA和tRNA变环以及microRNA（miRNA）中。此外，大多数真核mRNA在N7-鸟嘌呤的5′帽端含有m7G修饰。随着灵敏度更高的检测和定位技术发展，研究人员最近发现m7G修饰存在于mRNA内部区域。在人类和小鼠细胞系的去帽poly(A)+ mRNA中，m7G/G占比约为0.02%–0.05%，占相同细胞中m6A/A的5%–10%（使用LC-MS/MS）。Zhang等人（2019b）报告称，m7G峰值主要积聚区域位于3′UTR，次要区域在5′UTR内部mRNA中。另一项报告也发现，人类和小鼠mRNA内部的m7G修饰富集在5′UTR，特别是在翻译起始位点附近的AG富集区域。
与m6A和m5C相比，关于m7G调控因子的研究才刚刚开始。报道的m7G甲基转移酶包括Trm8p/Trm82p复合体和酵母中的Bud23/Trm112，以及哺乳动物中相应的同源物METTL1/WDR4和WBSCR22/TRMT112，其中METTL1不仅介导tRNA上的m7G修饰，还催化mRNA内部m7G修饰。此外，RNMT和RAM复合体参与催化哺乳动物N7-鸟嘌呤5′帽端的m7G修饰的形成。最新研究报告称，QKI（QKI15、QKI16和QKI17）是mRNA内部m7G修饰的第一个reader蛋白，它在应激条件下与G3BP1互作，抑制m7G修饰的mRNA形成应激颗粒，同时调控Hippo信号通路中关键基因的稳定性和翻译效率（表1）。
检测技术
基于Bulk RNA甲基化检测技术
基于免疫沉淀方法
抗体和免疫沉淀的RNA甲基化检测策略，是一种简单、稳定且低成本的方法，传统上被广泛用于各种生物的表观转录组特征图谱绘制。典型的技术分为两类：基于RNA甲基化抗体的（包括m6A/m5C/m7G-MeRIP-seq、m6A/m7G-miCLIP-seq、PA-m6A-seq和m6A-LAIC-seq）和基于甲基转移酶抗体的（m5C-miCLIP-Seq和AZA-IPseq）。
(1) MeRIP-seq
大多数用于RNA甲基化修饰的高通量测序技术依赖于特定甲基化抗体（如m6A、m5C和m7G）。甲基化RNA免疫沉淀测序（MeRIP-seq），如m6A-MeRIP-Seq（m6A-seq）（图1A）、m5C-MeRIP-Seq（图2A）和m7G-MeRIP-Seq（图3A）是常用的方法，用于鉴定mRNA中的RNA甲基化peaks。然而，MeRIP-seq存在一些缺点，如相对较低的检测分辨率（约100-150 nt）和对低丰度RNA上的RNA甲基化位点不敏感。Molinie等人（2016年）改进的m6A-MeRIP-seq开发了m6A-LAIC-seq（m6A水平和异构体特征序列），通过调整抗体使用、涉及各种内标调控和同时进行上清液（m6A阴性部分）的NGS测序，计算m6A阳性和m6A阴性部分的RNA表达，以在全转录组范围内定量m6A的化学计量学（表2）。
(2) miCLIP-seq
通过将MeRIP技术与光交联反应结合，研究人员发明了UV诱导的抗体-RNA交联方法来检测转录组甲基化修饰，如PA-m6A-Seq（光交联辅助m6A测序）（图1C）、m6A-CLIP（m6A交联免疫沉淀）（和m6A/m7G-miCLIP（m6A/m7G甲基化单碱基分辨率交联免疫沉淀）（图1B和3B）。m6A-CLIP和m6A/m7G-miCLIP均基于UV交联RNA与m6A或m7G抗体在结合位点形成共价键，导致逆转录过程中的C-T位点转换或截断，通过此方法可以准确鉴定m6A位点并获得单碱基分辨率甲基化图谱（表2）。
(3) PA-m6A-seq
PA-m6A-seq（光交联辅助m6A测序）方法依赖于4-硫尿苷（4SU，光敏感的核苷酸类似物）在细胞培养期间并入poly(A) RNA中，抗m6A免疫沉淀和UV交联，随后进行靶向RNA洗脱和文库构建（图1C）。与MeRIP-Seq或m6A-seq相比，该方法实现哺乳动物接近单碱基分辨率全转录组m6A图谱（表2）。
(4) m5C-miCLIP-seq
甲基转移酶可以催化体内特定核酸碱基位点的RNA甲基化形成。m5C甲基转移酶NSUN2包含释放（半胱氨酸271）和催化（半胱氨酸321）位点。m5C-miCLIP（m5C甲基化单碱基分辨率交联和免疫沉淀）利用这一特性，通过结合细胞中外源表达的NSUN2-C271A（NSUN2上的突变释放位点）与UV交联免疫沉淀，其中突变蛋白NSUN2-C271A和m5C修饰位点在UV交联下强烈结合形成共价键，这在RT-PCR过程中引起截断或突变（图2B）。因此，m5C-miCLIP也能够以单碱基分辨率检测m5C修饰位点（表2）。
(5) AZA-IP-seq
AZA-IP-seq（5-氮胞嘧啶介导的RNA免疫沉淀测序）是另一种基于甲基转移酶抗体的m5C检测方法。简要来说，5-氮胞嘧啶（5-azaC），作为DNA甲基转移酶抑制剂之一，可以随机并入DNA和新生RNA中，并且也有能力与甲基转移酶（外源和内源）结合形成共价键。结合5-azaC处理和特定甲基转移酶抗体（如NSUN2）的免疫沉淀，可以以单碱基分辨率检测m5C修饰位点（图2A，表2）。
表1：mRNA甲基化修饰调控因子综述
基于化学反应方法
(1) RNA-BisSeq
RNA亚硫酸盐测序（RNA-BisSeq）是定量分析mRNA m5C甲基组的经典方法之一。它依赖于用亚硫酸盐预处理RNA，促使未修饰的C发生化学脱氨反应并转化为U，而甲基化的胞嘧啶（m5C）保持为C。经过RT、cDNA合成和PCR过程后，U碱基转化为T，从而可以区分m5C和C。通过生物信息学分析，可以通过分析未转化的胞嘧啶来鉴定m5C修饰位点，同时，通过计算未转化胞嘧啶的覆盖率百分比来估计m5C甲基化水平（图2D）。总的来说，RNA-BisSeq不需要在细胞中表达外源基因或化学试剂，能够准确捕获细胞和组织中原始的m5C修饰状态。RNA-BisSeq被广泛用于探索各种RNA中m5C的表达特征，并预测其潜在功能，包括哺乳动物、斑马鱼、拟南芥和水稻。RNA-BisSeq中m5C检测的准确性取决于亚硫酸盐处理过程中C到U的转化效率，这受到反应条件（如温度、反应时间）和RNA状态（如RNA质量、RNA二级结构等）的影响（表2）。
(2)m6A-SEAL-seq
FTO辅助的m6A选择性化学标记测序（m6A-SEAL-seq）是一种利用FTO作为催化剂将m6A转化为hm6A（N6-羟甲基腺苷）的化学标记方法。不稳定的hm6A将通过二硫苏糖醇（DTT）介导的硫醇加成化学反应转化为更稳定的dm6A（N6-二硫代肌醇甲腺苷）。然后，dm6A通过甲硫磺酸盐（MTSEA）响应组装生物素标签，随后进行链霉亲和纯化和测序（图1D）。m6A-SEAL分辨率约为200 nt（表2）。
(3) m6A-label-seq
这种技术基于甲硫氨酸类似物Se-烯丙基硒代同型半胱氨酸作为人类和小鼠细胞的培养营养物质。这种类似物可以驱动甲基供体SAM被烯丙基团标记，通过细胞自身代谢形成Allyl-SAM或Allyl-SeAM。因此，细胞RNA能够在假定m6A生成腺苷位点被代谢性地修饰为N6-烯丙基腺苷（a6A）。基于碘化诱导的a6A环化和在cDNA逆转录过程中对侧位点错配，实现全转录组范围内单碱基分辨率检测。m6A-label-seq的建立为理解m6A在分子水平上的生理作用提供了强有力的工具，并且可以应用于所有m6A motif。烯丙基团标记的效率和时间窗口对于准确鉴定m6A位点至关重要（表2）。
(4) m6A-SAC-seq
m6A选择性烯丙基化学标记和测序（m6A-SAC-seq）是单碱基分辨率绘制全转录组m6A图谱方法之一。这种方法的本质是使用Dim1/KsgA家族的二甲基转移酶酶（MjDim1）在m6A上添加烯丙基SAM化学基团形成烯丙基6m6A，随后在I2处理后发生环化。环化的烯丙基6m6A在逆转录过程中将被read为突变。根据突变reads，可以定量和分析转录组中m6A沉积位点（图1F）。m6A-SAC-seq能够覆盖几乎所有经典的m6A motif，并已应用于检测HeLa、HEK293、HepG2以及造血干细胞（HSC）和单核细胞中的m6A水平。m6A-SAC-seq的初始样本量约为30ng的poly(A)或rRNA耗尽RNA（表2）。
(5) GLORI
类似于RNA m5C的RNA-BisSeq，乙二醛和亚硝酸盐介导的未甲基化腺苷的脱氨（GLORI）也是一种无偏倚、绝对基于化学反应的m6A定量方法。该程序包含三个连续步骤：①使用乙二醛形成可逆结构保护G（N1, N2-二羟基鸟嘌呤加合物）以避免亚硝酸盐诱导的G脱氨；②未甲基化的A通过亚硝酸盐催化的脱氨反应转化为I；③通过碱性或加热条件处理实现G的脱保护（图1G）。GLORI的主要优势是实现RNA中m6A定量分析，但GLORI成本高于m6A MeRIP-seq，且GLORI无法区分m6A和其他一些A修饰，如m6Am和m1A，尽管技术发明者声称已开发出分析流程来消除由m6Am和m1A引起的假阳性（表2）。
(6) eTAM-seq
进化的TadA辅助N6-甲基腺苷测序（eTAM-seq）是一种基于酶促脱氨反应的单碱基分辨率m6A测序方法，用于全转录组范围内定量检测m6A位点。简要来说，使用高活性的tRNA腺苷脱氨酶TadA8.20进行脱氨反应，全局未甲基化的A转化为I，只能与C配对并在随后的逆转录、文库构建和测序过程中被读为G。修饰的m6A保持不变，在测序过程中仍然被读为A。因此，通过eTAM-seq，A被读为G，m6A被读为A。eTAM-seq能够在极少量RNA中（低至10个细胞的RNA）进行m6A的定量检测，其初始RNA需求远低于现有的m6A定量分析方法（图1H）。
(7) TAWO-seq
TET辅助的过钨酸盐氧化测序（TAWO-seq）也是一种 RNA m5C单碱基分辨率测序方法，主要包含三个连续程序，包括由β-葡萄糖转移酶（βGT）标记保护的原始hm5C，由TET酶氧化的原始m5C转化为hm5C，以及由过钨酸盐介导的新生成hm5C的选择性氧化为三羟基胸腺嘧啶（thT）（图2E）。这项技术的最大优势是与RNA-BisSeq相比能够区分m5C和hm5C。
(8) m7G-seq
m7G上的正电荷对NaBH4介导的还原特别敏感。m7G-seq采用NaBH4介导的还原，在m7G位置上产生一个碱性位点，然后这些位点被生物素标记，随后进行生物素下拉实验。在逆转录过程中，RNA中的生物素标记m7G位点会导致错配（主要是T以及其他碱基），从而实现基于这些突变的m7G甲基组的单碱基分辨率（图3C，表2）。
基于酶切反应技术
MAZTER-seq和m6A-REF-seq（m6A敏感的RNA内切核酸酶促进的测序）是同时报道不依赖抗体的方法，用于定量m6A的化学计量分析。这两种方法都依赖于RNA内切核酸酶MazF对ACA motif上的m6A识别，能够在全转录组范围内以单碱基分辨率检测m6A修饰位点及其丰度。MazF在mRNA上更倾向于识别A-CA motif。由于RNA上m6A的motif是RRACH（R=A/G，H=A/C/U），大多数经过MazF酶处理后的读段将在5'端含有ACA，因此内部的(m6A)CA基序被认定为甲基化位点（图1I和J）。然而，这两种方法都受限于内切核酸酶对m6A CA序列的选择性，这使得不包含m6A CA序列的序列无法被识别（表2）。
基于RNA编辑的技术
DART-seq（脱氨基作用邻近RNA修饰靶标测序）是一种不依赖抗体的方法，通过在哺乳动物细胞中表达外源性的APOBEC1-YTH融合蛋白来检测全局m6A修饰位点。其中，YTH（m6A结合域）识别m6A，而连接的APOBEC1（胞嘧啶脱氨酶）直接将胞嘧啶残基上的C编辑为U。这些编辑位点在后续的数据分析中被识别为m6A修饰区域（图1K）。由于YTH结构域与m6A的2'-OH之间的氢键键合是关键结构，DART-seq中的YTH结构域无法识别m6Am。尽管DART-seq能够从低量RNA（约10 ng总RNA）中绘制m6A位点，但需要将APOBEC1-YTH短暂转染入哺乳动物细胞要求限制了其应用，并且可能破坏了生理状态（表2）。
图1：mRNA甲基化测序技术的发展。过去十年m6A测序技术取得快速发展，在单碱基分辨率（约八种类型）和单细胞水平（约三种类型）上取得了突破：包括基于m6A抗体的（A）m6A-seq/MeRIP-seq、（B）miCLIP和（C）PA-m6A-seq；基于化学反应的（D）m6A-SEAL-seq、（E）m6A-label-seq、（F）m6A-SPAC-seq和（G）GLORI、（H）eTAM-seq。
图2：mRNA m5C甲基化测序技术。基于抗体m5C检测方法，包括基于甲基转移酶或其融合标签抗体的技术（A）AZA-seq和（B）m5C miCLIP-seq，以及基于m5C抗体的方法（C）m5C MeRIP-seq。基于化学反应的技术是（D）RNA-BisSeq和（E）TAWO-seq。
图3：mRNA m7G甲基化测序技术。目前有三种流行的m7G检测测序技术，包括（A）m7G MeRIP-seq和（B）基于m7G抗体富集的m7G-miCLIP-seq以及（C）基于化学反应的m7G-seq。
与单细胞组学图谱相比，传统的群体细胞测序方法使用的样本包含成千上万个细胞，因此只能反映群体中的平均甲基化水平。特别是，细胞表达的异质性在很大程度上被掩盖，无法准确反映组织/器官的真实生理或病理特征。目前已经建立单细胞水平的测序技术，用于绘制转录组、染色质开放可及性、DNA甲基化修饰等图谱。报道的单细胞转录组甲基化图谱技术包括scDART-seq和scm6A-seq。
(1) scDART-seq
scDART-seq是在引入10X Genomics单细胞测序后从DART-seq发展而来，是首个单细胞水平的m6A检测方法。通过应用scDART-seq，在成千上万个单细胞中进行m6A图谱分析，发现m6A在单细胞水平上表现出高度异质性，并且可以根据RNA甲基化特征区分细胞亚群，与基因表达水平无关。这些发现揭示以前在bulk-cell m6A分析中被忽视的m6A基本特征，并为理解m6A在不同细胞中的功能提供新见解（图1L）。但由于scDART-seq基于外源基因表达，因此很难应用于组织样本，也无法呈现细胞的原始状态（表2）。
(2) scm6A-seq
通过结合RNA多重标记和MeRIP-seq/m6A-IP，scm6A-seq能够捕获全转录组范围的m6A图谱，并能够在不表达任何外源基因的情况下比较单细胞中的m6A水平。它已被用于区分有核仁包围（SN）和无核仁包围（NSN）的卵母细胞，以单细胞分辨率绘制小鼠卵母细胞发育和合子基因组激活期间的m6A调控机制（图1M，表2）。
(3) picoMeRIP-seq
picoMeRIP-seq也是一种基于m6A抗体的低输入RNA/细胞或单细胞启动的m6A图谱方法。与scm6A-seq相比，picoMeRIP-seq不标记单细胞中的RNA，后续文库构建直接使用商业的SMART-Seq stranded kit（TaKaRa）。在这种方法中，通过系统优化关键步骤提高了m6A/A富集比率，包括增加洗涤剂（SDS）和盐（NaCl）浓度，使用低结合管和商业m6A抗体（Millipore）等（图1N）。picoMeRIP-seq已用于在100 pg poly(A) RNA、单个斑马鱼合子、单个小鼠卵母细胞和植入前胚胎、小鼠胚胎干细胞（1,000、100和10个细胞）的全转录组水平上绘制m6A（表2）。
综上所述，过去十年中RNA甲基化测序技术的快速发展使我们能够更清晰地了解RNA甲基化修饰的分布特征和功能机制。尽管每种技术都有其自身的优势和劣势，但它们可以从多个维度进行补偿或校正，以获得更准确的RNA甲基化位点信息。此外，在单碱基精度和单细胞水平上取得了技术突破，这可以更精细地捕获细胞间RNA甲基化的异质性，并建立单细胞水平的RNA甲基化调控网络。
生物学功能
RNA过程和代谢
作为转录后修饰，RNA甲基化参与RNA代谢的整个过程，如pre-mRNA剪切、mRNA出核、mRNA降解或稳定性以及mRNA翻译。
pre-mRNA剪切
pre-mRNA剪切作为基因表达转录后调控的第一阶段，是去除pre-mRNA中内含子、有序连接外显子以最终生成成熟mRNA的过程。pre-mRNA可变剪切是这一过程中的关键步骤，它可以从一个基因生成多个转录本，为遗传多样性和复杂性做出贡献。m6A去甲基化酶（FTO和ALKBH5）和甲基转移酶复合体（WTAP、METTL3和METTL14）定位于核斑点中，提示m6A在RNA剪切中的潜在作用。FTO优先结合内含子区域pre-mRNA，靠近可变剪切（AS）外显子和聚腺苷酸位点，并调控可变剪切和3′UTR表达。
m6A reader蛋白hnRNPG结合到共转录新生的m6A修饰pre-mRNA，并通过对RNA聚合酶II的互作及其在hnRNPG调控外显子周围的占位影响来调控可变剪切。此外，m6A分布在围绕5′-和3′-剪切位点的外显子区域，并与SRSF1和SRSF2的结合簇空间重叠。在3T3-L1细胞中敲除FTO增强了m6A水平，并促进了SRSF2蛋白的RNA结合能力，该蛋白调控脂肪生成调控因子RUNX1T1的可变剪切和随后的前脂肪细胞分化。同时，有报道称m6A参与依赖其阅读蛋白YTHDC1的pre-mRNA剪切，促进pre-mRNA剪切因子SRSF3（SRp20）而阻止SRSF10（SRp38）进入目标mRNA的结合区域。小鼠卵母细胞中的Ythdc1与pre-mRNA 3′端处理因子（CPSF6、SRSF3和SRSF7）互作，并以m6A依赖方式广泛参与可变聚腺苷酸化和改变3′UTR长度。果蝇中YTH家族蛋白的同源物YT521-B介导依赖于m6A的pre-mRNA可变剪切，并调控果蝇的神经功能和性别决定。Louloupi等人报告称，剪切位点上的m6A沉积促进快速剪切，而内含子中高m6A水平与慢可变剪切相关。有趣的是，m6A开关调控HNRNPC结合活性，其中m6A主导RNA和reader蛋白互作的RNA结构依赖性可及性，促进外显子保守并影响目标mRNA的可变剪切。总的来说，m6A对pre-mRNA成熟过程发挥重要作用，但m5C或m7G是否也参与这一过程尚不清楚。
mRNA出核
mRNA出核是基因表达过程中的关键步骤，mRNA通过这一步骤被转运到细胞质中进行翻译。大多数mRNA出核依赖于转录出核复合体（TREX）和核异二聚体出核受体（NXF1-P15）通路，其中TREX复合体成员被沉积在mRNA上并将其交给NXF1。
YTHDC1通过剪切因子SRSF3和出核接头NXF1促进含m6A的mRNA出核。研究发现多个TREX亚基（ALYREF、UAP56、THOC5、CHTOP）与m6A甲基转移酶复合体（WTAP、METTL3、METTL14、KIAA1429）互作，调控转录本出核。Mettl3在细胞核中显著增加了时钟基因Per2和Arntl的mRNA积累，而细胞中ALKBH5缺失加速了mRNA的RNA出核。同时，HeLa细胞中YTHDC1缺失导致m6A修饰的mRNA核积聚，而在细胞质中缺失。
除了m6A，m5C也在mRNA出核中发挥关键作用。ALYREF不仅是m5C reader蛋白，也是调控核质穿梭的TREX亚基之一。在HeLa细胞中，ALYREF促进含m5C的mRNA出核。3T3-L1细胞中NSUN2的缺乏导致ALYREF-m5C轴介导的CDKN1A mRNA出核减少，导致细胞周期加速和促进脂肪形成。
mRNA降解和稳定性
m6A修饰参与调控mRNA代谢。在野生型mESCs中，Mettl3和Mettl14组成的甲基转移酶复合体在标靶转录本上催化m6A形成，随后阻止与mRNA稳定性相关蛋白HuR的结合，并增强microRNA靶点，导致目标转录本不稳定。YTHDF2是一个经典的m6A reader蛋白，它通过多种通路促进含有m6A的靶转录本降解。首先，Wang等人（2014a）分析了YTHDF2蛋白结构，发现YTHDF2的羧基末端域（C-YTHDF2）选择性地识别含m6A mRNA，而氨基末端域（N-YTHDF2）负责将YTHDF2-m6A-mRNA复合体定位到更专门的mRNA降解机器（如P体等）。其次，哺乳动物细胞中的YTHDF2招募CCR4-NOT脱腺苷酸酶复合体，加速含m6A RNA的脱腺苷酸化和降解。此外，YTHDF2还与HRSP12互作，招募RNase P/MRP复合体（内切核糖核蛋白酶复合体），以切割含m6A的RNA。YTHDF2介导的m6A甲基化mRNA的降解在各种发育和疾病过程中发挥关键作用，如维持造血干细胞功能、在卵母细胞成熟和胚胎发生过程中母源mRNA降解、癌症进展等。
与YTHDF2作用不同，另一个m6A reader蛋白IGF2BPs参与维持稳定性和储存，并在正常和应激条件下影响目标m6A甲基化mRNA基因表达。IGF2BPs介导的m6A修饰mRNA的稳定性参与肿瘤形成。
m5C修饰在mRNA稳定性中也表现出类似的作用。两项平行研究报告称，m5C reader蛋白YBX1通过招募RNA稳定性相关蛋白（HuR或PABPC1a）影响目标mRNA稳定性，并因此参与膀胱尿路上皮癌（UCB）的肿瘤形成和转移，以及斑马鱼胚胎发育。在小鼠Th17细胞中NSUN2缺失以m5C依赖方式导致Il17a和Il17f mRNAs的半衰期和数量减少。
翻译
RNA甲基化已被证明可以促进或抑制翻译过程。在细胞质中，YTHDF1富集在40S核糖体的蛋白质亚基中，并与翻译启动复合体的组成部分eIF3互作，从而促进m6A依赖的mRNA翻译。
YTHDF3也与YTHDF1协同促进蛋白质合成。另一项平行研究也报告称，YTHDF3与YTHDF1合作，通过在翻译过程中顺序招募翻译效应物（40S和60S核糖体亚基）来促进m6A修饰目标mRNA的翻译效率。总体而言，YTHDF1和YTHDF3通过与YTHDF1/YTHDF3链接，在转录本m6A修饰的3'端和40S和60S亚基的翻译效应物的5'端之间形成loop，调控翻译启动。最近的报告还说明了几条分子通路参与YTHDF1或YTHDF3介导的m6A修饰转录本的翻译过程。Zou等人（2023年）报告称，YTHDF1与核糖体蛋白结合以促进其目标mRNA翻译，但FMRP通过阻碍YTHDF1与核糖体蛋白的结合来抑制神经翻译。然而在神经刺激下，FMRP被磷酸化并释放YTHDF1，以提高m6A甲基化mRNA翻译效率，从而促进神经去极化。同时，Chen等人（2023年）已经证明YTHDF1和YTHDF3（不是YTHDF2）携带高水平的营养感应O-GlcNAc修饰，O-GlcNAcylation通过抑制它们与mRNA翻译相关蛋白互作，抑制YTHDF1和YTHDF3的翻译促进功能，导致m6A甲基化mRNA翻译抑制。Chen等人（2023年）还建议不同的细胞在YTHDF1/3上表现出不同的O-GlcNAc修饰水平，这可能是先前研究对YTHDF1/3是否促进m6A RNA翻译功能得出不同结论的原因之一。此外，当m6A位于5'UTR时，它可以通过被43S复合体组分eIF3识别，在细胞应激下促进帽的单独翻译。另一个reader蛋白YTHDC2也以m6A依赖方式增强其靶标翻译效率。尽管如此，Choi等人（2016年）证明，转录本中m6A修饰密码子通过破坏转录本上tRNA的选择导致翻译延伸动态更慢和翻译效率更低。此外，Lin等人（2016年）发现METTL3，而不依赖其m6A催化活性，通过招募eIF3到翻译启动复合体，增强包括重要的癌基因如EGFR和TAZ在内的目标mRNA翻译，导致人类肺癌细胞的生长、存活和侵袭得到促进。
m5C广泛分布在rRNA和tRNA变区和反密码loop上，通过调控tRNA稳定性和密码子识别、翻译保真度和准确性或全局蛋白质合成等参与翻译调控。mRNA上的m5C也参与调控翻译效率，在3T3-L1细胞中，NSUN2以m5C依赖的方式促进CDKN1A mRNA的翻译效率。在大鼠的T淋巴细胞中，NSun2介导的m5C修饰在高同型半胱氨酸血症诱导下促进IL-17A mRNA的翻译。此外，NSUN6特异性m5C位点富集在3'UTR中的CTCCA motif上，与翻译终止保真相关。然而，Tang等人（2015年）报告称NSun2通过在p27 mRNA的5'UTR上的胞嘧啶C64上甲基化，抑制p27翻译，表明mRNA上m5C位点可能决定其对翻译效率的调控效应。
真核mRNA的5'帽上m7G已被证明参与翻译调控。最近的研究还表明，mRNA内部的m7G修饰在mRNA翻译通路中起作用。METTL1组装的内部m7G修饰能够促进m7G修饰转录本翻译效率，而不依赖于其对全局翻译和tRNA甲基化的影响。内部m7G在人类mRNA沿的表现显示在翻译起始位点保守富集，而在H2O2或热休克处理下在CDS和3'UTR区域显著积累，促进mRNA翻译效率。此外，METTL1介导的m7G甲基化增强VEGFA mRNA翻译，促进人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的血管生成。
综上所述，RNA甲基化修饰在包括pre-RNA处理、mRNA代谢和翻译在内的整个mRNA表达过程中发挥重要作用，凸显其生物学意义。Li等人（2017c）证明METTL3/METTL14介导的m6A和NSUN2介导的m5C甲基化在p21 3'UTR中协同增强p21翻译，在氧化应激诱导的细胞衰老中导致p21表达升高，表明多种RNA甲基化修饰可能协同调控同一生物学事件。然而，仍然需要揭示这些修饰单独或协同调控mRNA表达过程的更多调控机制，这将有助于描绘多种RNA甲基化的调控网络。
哺乳动物发育
配子发生
一系列最新研究表明，RNA甲基化表观转录组在精子发生和卵子发生中扮演着至关重要的角色。Guo等人（2022年）通过LC-MS/MS分析发现，多种RNA修饰（如m5C、m3C、m7G、m2G、m22G、m1G和m1A）分布在人类精子的RNA中，这些修饰在弱精子症（AZS）和畸精子症（TZS）组中的水平显著高于正常精子症（NZS）组，特别是在TZS组中m5C和m6A的水平更高。在精子发生过程中，m6A作为一个重要的调控因子，参与哺乳动物精原细胞的有丝分裂、减数分裂和精子形成。Mettl3介导的m6A调控精原干细胞（SSCs）的增殖和分化，并影响减数分裂的启动。在雄性生殖细胞中敲除METTL3或METTL14会导致睾丸组织中SSCs快速耗竭甚至完全缺失。人类精子中METTL3上调导致m6A水平增加，进而增强精子运动能力，这是弱精子症的一个风险因素。此外，小鼠支持细胞特异性敲除Wtap会损害SSCs的自我更新和增殖能力，最终导致不育，通过干扰Wtap介导的m6A修饰基因的可变剪切。此外，ALKBH5介导的小鼠精原细胞和圆形精子细胞核中的m6A参与正确剪切和较长3'UTR mRNAs生成，这是精子发生的晚期减数分裂和单倍体阶段所必需的。敲除FTO会导致GC-1精原细胞系的染色体不稳定和G2/M阶段转换抑制。在小鼠中，Ythdc2在雄性或雌性生殖细胞中敲除导致异常的配子减数分裂，导致不育和睾丸及卵巢体积减小。同时，小鼠减数分裂细胞中条件性敲除Ythdc2导致转录组严重失调，包括编码微管网络蛋白的转录本，并导致减数分裂细胞和精原细胞在晚期减数分裂阶段的端粒聚集和凋亡。成年雄性小鼠Ythdc1缺陷导致缺乏任何生殖细胞，包括有丝分裂精原细胞，并表现出仅支持细胞的表型。在小鼠精原细胞中敲除Ythdf2通过m6A/mRNA降解通路下调基质金属蛋白酶表达，并影响细胞粘附和精原细胞增殖。此外，敲除m5C甲基转移酶NSun2对精原干细胞和支持细胞没有影响，但抑制了生殖细胞进入减数分裂的减数分裂阶段。
在卵子发生过程中，METTL3介导的m6A通过促进母源mRNA翻译效率对小鼠卵母细胞成熟是必需的。在卵母细胞的生殖泡（GV）阶段敲低Mettl3严重抑制卵母细胞的减数分裂成熟。同时，Yao等人（2023年）证明METTL3催化的m6A沉积促进了GV期卵母细胞中m6A修饰RNA降解。然而，Mu等人（2021年）报告称METTL3靶向Itsn2进行m6A修饰，随后增强其在GV阶段的稳定性，以促进卵母细胞发育过程中减数分裂的恢复。此外，母源YTHDF2负责以m6A依赖方式指导适当的母源转录本剂量，从而决定哺乳动物卵母细胞质量和雌性生育能力。卵母细胞中Ythdc1缺陷导致m6A依赖的可变剪切缺陷，导致卵母细胞成熟停滞和雌性不孕。在卵母细胞中特异性敲除KIAA1429导致GV期卵母细胞中m6A修饰RNA的异常代谢，导致GV卵母细胞无法进行生殖泡破裂（GVBD）和随后失去恢复减数分裂能力。此外，卵巢中Nsun5缺失导致m5C在mRNA外显子和3'UTR区域的时间依赖性下降，影响减数分裂阻滞缺陷2样2（MAD2L2）的mRNA稳定性、生长分化因子9（GDF9）的翻译效率、以及Brd8外显子区域的异常可变剪切，导致卵泡发育和卵巢功能障碍。有趣的是，NSUN2在人类和小鼠MI/MII期卵母细胞的细胞质中表达，可能促进NSUN2蛋白与母源mRNAs互作，并催化m5C形成。卵母细胞中m5C修饰转录本的逐渐增加和沉积可能在早期胚胎发生中起作用。
早期胚胎发育
RNA甲基化修饰在胚胎发育中发挥重要作用。在体外，小鼠GV期卵母细胞中METTL3缺失会阻碍受精后胚胎发育中的母系到合子转变（MZT）和合子基因组激活，可能是通过破坏母源mRNA降解。小鼠胚胎4细胞阶段的转录因子mRNA上，如Cdx2、Nanog、Sox2和Pou5f1的m6A修饰，可能参与调控合子基因激活（ZGA）过程。m6A reader蛋白YTHDF2在母源上是必需的，对于卵母细胞的能力和早期MZT过程，具有清除m6A修饰的母源mRNA作用。由METTL3依赖的m6A甲基化调控的HnRNPA2/B1在着床前胚胎发育期间在核和细胞质中表达，其功能缺陷会延缓4细胞阶段后的胚胎发育，并通过对胚泡中多能性的调控影响内细胞团（ICM）的形成。斑马鱼胚胎发生中的m5C reader蛋白YBX1招募Pabpc1a来维持m5C修饰的母源mRNA稳定性，促进有序的MZT过程。
对于小鼠胚胎干细胞（mESC），Wang等人报告称m6A甲基化对于维持mESC在其基础状态至关重要，Mettl3或Mettl14缺失会导致mESC失去自我更新能力，这是由于HuR-microRNA和m6A介导的RNA稳定性通路功能障碍。Zc3h13靶向核中的WTAP、Virilizer和Hakai的成分复合体上，催化m6A形成，然后促进mESC自我更新。Batista等人（2014年）证明小鼠和人类ESC中Mettl3缺失降低了m6A修饰水平，延长分化时Nanog表达，导致促进mESC自我更新和抑制mESC分化。此外，Mettl3介导的m6A甲基化维持多能性因子保真和及时下调，调控小鼠原始多能性解决过程中适当的谱系启动和分化。Mettl14介导的m6A调控mRNA表达和可变剪切，并进一步转换为原始多能性到启动多能性和外胚层分化的小鼠胚胎。更重要的是，METTL14缺失在E6.5和E7.5（胚胎日）导致严重的生长迟缓和异常形态。
免疫系统发育
免疫细胞起源于造血干细胞（HSCs）分化，其命运对整个免疫系统至关重要。越来越多的证据支持RNA甲基化从多个角度调控HSCs。斑马鱼胚胎中Mettl3缺失抑制了最早的HSPCs生成，通过破坏YTHDF2介导的动脉内皮基因 notch1a 和 rhoca 的m6A依赖性mRNA衰变。与斑马鱼中的功能一致，Mettl3-m6A-YTHDF2-Notch轴通路在小鼠HSPCs生成和明确的造血中也显示出不可或缺和保守的功能。小鼠中阶段特异性的Mettl3缺失导致HSCs积累，并因未能通过METTL3介导的m6A甲基化上调MYC表达而阻止HSC分化。Cheng等人（2019b）还证明m6A通过调控MYC mRNA稳定性维持HSC对称。同时METTL14在正常髓系造血过程中表达下调，并通过正向调控MYB和MYC mRNA稳定性和翻译，基于m6A方式促进HSPCs向髓系细胞分化。Ythdf2缺失通过促进与干细胞自我更新相关的转录因子m6A介导的mRNA稳定性，促进HSPCs和人类脐带血（hUCB）HSCs扩增。Mapperley等人（2021年）还报告称，造血特异性Ythdf2缺失导致m6A修饰和炎症反应相关转录本上调，并激活促炎通路，导致淋巴潜能丧失，随后髓系偏向和HSC扩增。并且老化的Ythdf2缺失HSCs导致多系造血重建失败。
RNA甲基化通过调控免疫相关基因的转录本代谢参与先天免疫。在巨噬细胞中，SOCS1作为SOCS家族蛋白之一，参与巨噬细胞激活的负反馈回路，通过促进目标信号蛋白的多泛素化和蛋白酶体降解，以防止压倒性的全身炎症，其在巨噬细胞中对感染的响应依赖于METTL14-m6A-YTHDF1轴。METTL3缺失导致m6A介导的mRNA稳定性和Irakm高表达，最终抑制TLR（Toll样受体）信号介导的巨噬细胞激活。树突状细胞（DCs）作为连接先天和适应性免疫反应的专业抗原呈递细胞（APCs），对启动适应性免疫反应、消除入侵病原体和维持免疫稳态至关重要。Mettl3催化的mRNA m6A甲基化增强了CD40、CD80和TLR4信号接头Tirap翻译，并促进DC激活和TLR4/NF-κB信号诱导的细胞因子产生。此外，NK细胞中的Ythdf2对IL-15/STAT5信号介导的NK细胞存活、增殖和效应功能是必需的，促进NK细胞的抗肿瘤和抗病毒免疫活性。小鼠肿瘤模型中Mettl3缺失下调m6A甲基化基因SHP-2表达，可能导致NK细胞对IL-15刺激应答降低，并抑制NK细胞在肿瘤微环境中的浸润和功能。
除了先天免疫，RNA甲基化还参与调控适应性免疫反应。Mettl3介导SOCS家族蛋白SOCS1、SOCS3和CISH的m6A形成及其随后的降解，降低了SOCS家族活性，从而促进IL-7介导的STAT5激活和naïve T细胞的稳态增殖和分化。在Tregs中敲除Mettl3/m6A增加了Socs mRNA表达，从而抑制IL-2-STAT5信号通路，维持Tregs抑制功能。Th17细胞敲除METTL3可以促进SOCS3 mRNA稳定性，从而抑制IL-17A和CCR5表达，破坏Th17细胞分化和浸润。METTL3介导的m6A稳定Tcf7转录本，允许正常产生TCF-1蛋白及其调控的T滤泡辅助（Tfh）细胞调控因子，促进了Tfh细胞分化、增殖和功能成熟。T细胞特异性敲除ALKBH5增强了CD4+ T细胞中m6A修饰水平，并下调Cxcl2和Ifng的mRNA稳定性和蛋白表达，导致CD4+ T细胞功能和中性粒细胞招募在自身免疫期间受到抑制。
与m6A相比，关于其他RNA甲基化修饰在免疫细胞中的功能机制的研究相对较少。在高同型半胱氨酸血症（HHcy）诱导的大鼠慢性炎症疾病模型中，NSun2通过催化m5C形成及其在T淋巴细胞中促进翻译来介导IL-17A表达上调。Yang等人（2023年）还发现NSun2特别与Th17细胞转录因子RoRγt结合，催化其靶标上的RNA m5C形成，包括Il17a和Il17f，从而增强其mRNA稳定性。小鼠CD4+ T细胞中Nsun2缺失特别抑制了Th17细胞分化，并缓解Th17细胞诱导的结肠炎发病机制。在系统性红斑狼疮（SLE）患者的CD4+ T细胞中，Nsun2表达和m5C修饰水平下调，高甲基化m5C转录本主要参与mRNA剪切、稳定和翻译的细胞因子相关信号通路，而低甲基化m5C转录本主要参与翻译延伸。
总的来说，RNA甲基化修饰广泛参与生物体的发育过程，并在配子发生、胚胎发生以及胚胎后神经和免疫系统发育等多个功能通路中发挥关键作用。目前，m6A在发育研究中的关注度比其他修饰更多。随着检测技术的进步和各种RNA甲基化调控因子的鉴定，其他甲基化修饰在发育中的功能分析也可能变得有价值。
癌症
目前，已有数百项研究证明RNA甲基化通过直接作用或其调控元件参与包括癌症在内的多种疾病发生和发展的调控。以下仅总结一些最新的（过去五年）和尖端的关于肿瘤发生中RNA甲基化修饰的研究。越来越多的证据表明m6A失调驱动异常的转录和翻译程序，并随后促进疾病或肿瘤的发生和进展，如白血病、肝细胞癌（HCC）、肺癌（LC）、结直肠癌（CRC）、乳腺癌、膀胱癌（BC）、胰腺癌（PC）、胃癌（GC）、胶质母细胞瘤。m6A在癌细胞代谢中发挥重要作用，包括通过调控代谢相关通路，如mTOR、PTEN、MAPK、NF-κB、Wnt信号通路等，或转录因子，如HIF-1、FOXM1、cMyc、YAP。m6A还参与重塑各种肿瘤免疫，通过调控免疫细胞的生存或功能，包括B细胞、CD8+ T细胞、CD4+ T细胞、PD-1+ T细胞、Treg细胞、NK细胞、DC细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和CD4+记忆激活T细胞的浸润，以及免疫相关细胞因子的表达，如FN-γ、CXCL9和CXCL10。总体而言，m6A影响肿瘤发生和转移、代谢、免疫逃逸，在诊断和治疗方面具有潜在价值。
m5C调控因子，如NSUN2的甲基转移酶和YBX1的reader蛋白，在肿瘤组织中高表达。m5Cs在肿瘤组织中也经常出现高甲基化，并在致癌通路中富集。NSUN2和YBX1在UCB中靶向HDGF基因3'UTR的m5C，调控HDGF mRNA稳定性并促进UCB发病机制。丙酮酸激酶肌肉同工酶M2（PKM2），作为一种限速的糖酵解酶，参与肿瘤代谢和生长，其mRNA的3'UTR含有m5C位点。ALYREF直接识别PKM2 mRNA并以其m5C依赖性方式促进其稳定性，从而促进糖酵解和膀胱癌的肿瘤发生。类似的研究还表明，NSUN2介导的食管鳞状细胞癌（ESCC）中的m5C高甲基化通过增强LIN28B依赖的GRB2 mRNA稳定性，激活致癌的PI3K/AKT和ERK/MAPK信号，促进ESCC的起始和进展。NSUN2通过以m5C依赖方式上调TEAD1增强下咽鳞状细胞癌（HPSCC）的增殖和侵袭。在HCC中，NSUN2介导的m5C修饰在HCC中明显高于相邻非癌组织。m5C通过抑制Ras通路活性并增加HCC细胞对索拉非尼的敏感性来调控HCC进展，并且m5C修饰的lncRNA H19招募G3BP1致癌蛋白促进HCC发生和发展。此外，蛋白质翻译后修饰通过修饰RNA甲基化reader蛋白参与调控m5C靶标，并影响肿瘤发生。SIAH1通过泛素化和降解YBX1间接促进m5C修饰RNA不稳定性，抑制上皮卵巢癌细胞的增殖、侵袭、迁移和药物抗性。
几项研究表明m7G tRNA修饰影响癌症进展。METTL1/WDR4敲除破坏m7G tRNA解码密码子形成，降低mRNA翻译效率并抑制肺癌、HCC、BC和鼻咽癌（NPC）进展。METTL1介导的HeLa细胞中mRNA内部m7G也增强其靶标mRNA的翻译效率，而不依赖其对全局翻译和tRNA甲基化的影响。METTL1催化的人类脐静脉内皮细胞中VEGFA mRNA上的m7G组装增加了VEGFA翻译，并促进缺血后血管生成。这些研究表明内部m7G可能参与癌症进展。
总体而言，RNA甲基化修饰在肿瘤发生过程中发挥着关键作用，但不同修饰是否在肿瘤发生中协同或拮抗作用值得进一步研究。此外，尽管许多由RNA甲基化修饰调控的靶标和通路具有肿瘤诊断和治疗的潜力，但实际应用于临床设置很少，需要进一步深入研究以促进临床应用。
结论与展望
本文总结了包括m6A、m5C和m7G在内的三种甲基化表观转录组的调控元件、分布特征、检测技术以及生物学功能。由于RNA甲基化修饰在调控多种生理功能中的参与，主要概述了几个热点话题，包括配子发生、早期胚胎发生、免疫系统发育和疾病。尽管m6A和m5C RNA修饰的调控元件已经被发现并广泛研究，但关于其他RNA甲基化修饰的信息相对较少，特别是其erasers和readers需要确定。随着对其他RNA甲基化修饰动态性质的调控元件和机制的深入研究，对其功能机制的更清晰理解将有助于建立整体RNA表观遗传修饰调控网络。
尽管已经开发了各种RNA甲基化修饰的测序技术，但它们中的大多数只能很好地捕获和分析高丰度而不是低丰度转录本中的修饰信息，而后者将是一个有意义的突破点。此外，越来越多的研究表明RNA甲基化修饰参与多种生物过程和肿瘤发生。然而，几乎所有的研究都是在群体细胞水平上进行的，这可能会忽视或扭曲单个细胞中的真实信息，限制对精确调控机制的理解，这对于指导疾病的精确靶向治疗可能至关重要。因此，开发高通量单细胞RNA甲基化技术应该是该领域的创新点和推动力。此外，几项研究也表明多种RNA甲基化修饰可能共同调控某些生物过程。因此，探索不同RNA修饰之间的相互调控关系可能是未来的一个热点话题，这对于构建整体RNA表观遗传修饰调控网络是必要的。目前能够同时捕获多种修饰的测序技术仍然相对较少，修饰类型的覆盖范围和灵敏度仍需改进。因此，开发新技术以同时检测多种RNA表观遗传修饰是理解生物系统中整体作用模式的必要条件。
从文章的疾病部分来看，RNA表观遗传修饰及其调控因子在各种肿瘤的增殖、侵袭和迁移中发挥重要作用。此外，多个RNA甲基化修饰基因或其通路已被报道作为诊断或治疗的潜在靶标，但其目前的临床应用仍然非常有限。因此，需要加强特定RNA甲基化修饰抑制剂的研究，这可能是实现RNA甲基化修饰临床转化应用的关键点，尽管已有一些抑制剂的报道，如FTO抑制剂、Meclofenamic酸、FB23/FB23-2、MA2、Entacapone、DAC51、R-2HG、CS1/CS2、METTL3抑制剂（包括Compound 2/Compound 7）、STM2457、YTHDF2抑制剂（包括DC-Y13-27）和IGF2BP1抑制剂（包括BTYNB）。此外，几项研究表明RNA甲基化修饰可以用于靶向编辑。在细胞水平上，表达与截短的METTL3甲基转移酶结构域融合的核定位dCas13，与修饰的METTL3-METTL14甲基转移酶复合体和特定导向RNA融合的细胞质定位，有能力在mRNA中将特定位点的腺苷修饰为m6A。Liu等人（2019b年）还设计了一个m6A动态编辑系统，将CRISPR-Cas9与单链m6A甲基转移酶METTL3:METTL14融合以在特定位点编程m6A形成，同时将CRISPR-Cas9与ALKBH5或FTO融合以实现RNA的位点特异性去甲基化。然而，这些技术都是基于细胞内编辑相关蛋白的表达，使得直接治疗如人类肿瘤等疾病变得困难，而其他RNA甲基化的RNA编辑技术大多未知。此外，考虑到RNA甲基化修饰对mRNA代谢和翻译有显著影响，研究体外RNA甲基化靶向编辑技术对于增强mRNA药物的效力具有重要意义。
总之，对RNA甲基化修饰的调控蛋白组分、测序技术、功能机制、抑制剂和靶向编辑技术的深入研究将提供关于RNA甲基化修饰在生物发育和疾病发生中功能角色的广阔视野，对于疾病诊断和治疗也具有宝贵的视角。
mRNA的分布特征和调控元件
m6A
m6A是研究最广泛的RNA甲基化修饰类型，几乎存在于所有类型的RNA中，包括染色质相关新生pre-mRNA（chromatin-associated nascent pre-mRNA，caRNA）、成熟mRNA和非编码RNA（ncRNA）。约25%哺乳动物细胞mRNA含有m6A，每个转录本平均含有三个m6A残基。利用LC-MS/MS技术鉴定出人类mRNA中m6A/A占比约0.4%–1.79%。m6A主要位于内部mRNA中，特别是在靠近终止密码子和mRNA的3′UTRs区域。m6A的保守motif序列是RRACH（R=A/G，H=A/C/U）。m6A的分布特征表明m6A可能广泛参与mRNA代谢，如可变剪切、翻译等，从而在生理和病理过程中发挥重要作用。m6A甲基化形成由甲基转移酶（“writers”）催化，主要由METTL3、METTL14和WTAP组成，以及其他蛋白亚基，包括ZC3H13/Hakai/Virilizer、KIAA1429（VIRMA）、RBM15/15B。METTL16也是METTL同源家族蛋白之一，催化MAT2A mRNA和U6 snRNA上的m6A形成。同时m6A甲基基团能够被去甲基化酶（“erasers”）去除，主要包括FTO和ALKBH5家族成员。m6A修饰的RNA碱基位点被特定的结合蛋白（“readers”）识别以执行多样的生物学功能。迄今为止已鉴定的m6A readers包括YTH结构域蛋白（YTHDC1-2、YTHDF1-3）、核异质核糖核蛋白（HNRNPC、HNRNPA2B1）、类胰岛素生长因子2 mRNA结合蛋白（IGF2BP1-3）、真核起始因子3（eIF3）（表1）。
m5C
m5C是另一种常见且丰富的RNA修饰，存在于各种RNA中，包括mRNA、tRNA、rRNA和vtRNA。在人类和小鼠的mRNA中，m5C位于翻译起始位点（TSS）的下游区域，通过LC-MS/MS检测人类mRNA中m5C/C占比约为0.02%–0.09%。
与m6A类似，m5C修饰也由其“writers”和“erasers”动态调控。已经鉴定的几个m5C甲基转移酶（writers），包括NOL1/NOP2/SUN结构域家族成员（NSUN1-7）、DNA甲基转移酶同源物（DNMT2）和特异性tRNA甲基转移酶家族成员（TRDMT4A和TRDMT4B），其中NSUN2和NSUN6能够催化mRNA上m5C形成。Tet家族蛋白（TET1和TET2）不仅催化DNA上5mC到5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）的形成，还介导mRNA中m5C氧化。目前，有两种主要类型的mRNA m5C readers蛋白，其具有特殊的RNA结合域，以决定m5C修饰RNA分子的不同命运，包括RNA和出口因子结合蛋白2（ALYREF）和Y-box结合蛋白（YBX1和YBX2）（表1）。
m7G
m7G也是一种普遍存在的RNA甲基化修饰，被发现位于真核生物的18S rRNA和tRNA变环以及microRNA（miRNA）中。此外，大多数真核mRNA在N7-鸟嘌呤的5′帽端含有m7G修饰。随着灵敏度更高的检测和定位技术发展，研究人员最近发现m7G修饰存在于mRNA内部区域。在人类和小鼠细胞系的去帽poly(A)+ mRNA中，m7G/G占比约为0.02%–0.05%，占相同细胞中m6A/A的5%–10%（使用LC-MS/MS）。Zhang等人（2019b）报告称，m7G峰值主要积聚区域位于3′UTR，次要区域在5′UTR内部mRNA中。另一项报告也发现，人类和小鼠mRNA内部的m7G修饰富集在5′UTR，特别是在翻译起始位点附近的AG富集区域。
与m6A和m5C相比，关于m7G调控因子的研究才刚刚开始。报道的m7G甲基转移酶包括Trm8p/Trm82p复合体和酵母中的Bud23/Trm112，以及哺乳动物中相应的同源物METTL1/WDR4和WBSCR22/TRMT112，其中METTL1不仅介导tRNA上的m7G修饰，还催化mRNA内部m7G修饰。此外，RNMT和RAM复合体参与催化哺乳动物N7-鸟嘌呤5′帽端的m7G修饰的形成。最新研究报告称，QKI（QKI15、QKI16和QKI17）是mRNA内部m7G修饰的第一个reader蛋白，它在应激条件下与G3BP1互作，抑制m7G修饰的mRNA形成应激颗粒，同时调控Hippo信号通路中关键基因的稳定性和翻译效率（表1）。
检测技术
基于Bulk RNA甲基化检测技术
基于免疫沉淀方法
抗体和免疫沉淀的RNA甲基化检测策略，是一种简单、稳定且低成本的方法，传统上被广泛用于各种生物的表观转录组特征图谱绘制。典型的技术分为两类：基于RNA甲基化抗体的（包括m6A/m5C/m7G-MeRIP-seq、m6A/m7G-miCLIP-seq、PA-m6A-seq和m6A-LAIC-seq）和基于甲基转移酶抗体的（m5C-miCLIP-Seq和AZA-IPseq）。
(1) MeRIP-seq
大多数用于RNA甲基化修饰的高通量测序技术依赖于特定甲基化抗体（如m6A、m5C和m7G）。甲基化RNA免疫沉淀测序（MeRIP-seq），如m6A-MeRIP-Seq（m6A-seq）（图1A）、m5C-MeRIP-Seq（图2A）和m7G-MeRIP-Seq（图3A）是常用的方法，用于鉴定mRNA中的RNA甲基化peaks。然而，MeRIP-seq存在一些缺点，如相对较低的检测分辨率（约100-150 nt）和对低丰度RNA上的RNA甲基化位点不敏感。Molinie等人（2016年）改进的m6A-MeRIP-seq开发了m6A-LAIC-seq（m6A水平和异构体特征序列），通过调整抗体使用、涉及各种内标调控和同时进行上清液（m6A阴性部分）的NGS测序，计算m6A阳性和m6A阴性部分的RNA表达，以在全转录组范围内定量m6A的化学计量学（表2）。
(2) miCLIP-seq
通过将MeRIP技术与光交联反应结合，研究人员发明了UV诱导的抗体-RNA交联方法来检测转录组甲基化修饰，如PA-m6A-Seq（光交联辅助m6A测序）（图1C）、m6A-CLIP（m6A交联免疫沉淀）（和m6A/m7G-miCLIP（m6A/m7G甲基化单碱基分辨率交联免疫沉淀）（图1B和3B）。m6A-CLIP和m6A/m7G-miCLIP均基于UV交联RNA与m6A或m7G抗体在结合位点形成共价键，导致逆转录过程中的C-T位点转换或截断，通过此方法可以准确鉴定m6A位点并获得单碱基分辨率甲基化图谱（表2）。
(3) PA-m6A-seq
PA-m6A-seq（光交联辅助m6A测序）方法依赖于4-硫尿苷（4SU，光敏感的核苷酸类似物）在细胞培养期间并入poly(A) RNA中，抗m6A免疫沉淀和UV交联，随后进行靶向RNA洗脱和文库构建（图1C）。与MeRIP-Seq或m6A-seq相比，该方法实现哺乳动物接近单碱基分辨率全转录组m6A图谱（表2）。
(4) m5C-miCLIP-seq
甲基转移酶可以催化体内特定核酸碱基位点的RNA甲基化形成。m5C甲基转移酶NSUN2包含释放（半胱氨酸271）和催化（半胱氨酸321）位点。m5C-miCLIP（m5C甲基化单碱基分辨率交联和免疫沉淀）利用这一特性，通过结合细胞中外源表达的NSUN2-C271A（NSUN2上的突变释放位点）与UV交联免疫沉淀，其中突变蛋白NSUN2-C271A和m5C修饰位点在UV交联下强烈结合形成共价键，这在RT-PCR过程中引起截断或突变（图2B）。因此，m5C-miCLIP也能够以单碱基分辨率检测m5C修饰位点（表2）。
(5) AZA-IP-seq
AZA-IP-seq（5-氮胞嘧啶介导的RNA免疫沉淀测序）是另一种基于甲基转移酶抗体的m5C检测方法。简要来说，5-氮胞嘧啶（5-azaC），作为DNA甲基转移酶抑制剂之一，可以随机并入DNA和新生RNA中，并且也有能力与甲基转移酶（外源和内源）结合形成共价键。结合5-azaC处理和特定甲基转移酶抗体（如NSUN2）的免疫沉淀，可以以单碱基分辨率检测m5C修饰位点（图2A，表2）。
表1：mRNA甲基化修饰调控因子综述
基于化学反应方法
(1) RNA-BisSeq
RNA亚硫酸盐测序（RNA-BisSeq）是定量分析mRNA m5C甲基组的经典方法之一。它依赖于用亚硫酸盐预处理RNA，促使未修饰的C发生化学脱氨反应并转化为U，而甲基化的胞嘧啶（m5C）保持为C。经过RT、cDNA合成和PCR过程后，U碱基转化为T，从而可以区分m5C和C。通过生物信息学分析，可以通过分析未转化的胞嘧啶来鉴定m5C修饰位点，同时，通过计算未转化胞嘧啶的覆盖率百分比来估计m5C甲基化水平（图2D）。总的来说，RNA-BisSeq不需要在细胞中表达外源基因或化学试剂，能够准确捕获细胞和组织中原始的m5C修饰状态。RNA-BisSeq被广泛用于探索各种RNA中m5C的表达特征，并预测其潜在功能，包括哺乳动物、斑马鱼、拟南芥和水稻。RNA-BisSeq中m5C检测的准确性取决于亚硫酸盐处理过程中C到U的转化效率，这受到反应条件（如温度、反应时间）和RNA状态（如RNA质量、RNA二级结构等）的影响（表2）。
(2)m6A-SEAL-seq
FTO辅助的m6A选择性化学标记测序（m6A-SEAL-seq）是一种利用FTO作为催化剂将m6A转化为hm6A（N6-羟甲基腺苷）的化学标记方法。不稳定的hm6A将通过二硫苏糖醇（DTT）介导的硫醇加成化学反应转化为更稳定的dm6A（N6-二硫代肌醇甲腺苷）。然后，dm6A通过甲硫磺酸盐（MTSEA）响应组装生物素标签，随后进行链霉亲和纯化和测序（图1D）。m6A-SEAL分辨率约为200 nt（表2）。
(3) m6A-label-seq
这种技术基于甲硫氨酸类似物Se-烯丙基硒代同型半胱氨酸作为人类和小鼠细胞的培养营养物质。这种类似物可以驱动甲基供体SAM被烯丙基团标记，通过细胞自身代谢形成Allyl-SAM或Allyl-SeAM。因此，细胞RNA能够在假定m6A生成腺苷位点被代谢性地修饰为N6-烯丙基腺苷（a6A）。基于碘化诱导的a6A环化和在cDNA逆转录过程中对侧位点错配，实现全转录组范围内单碱基分辨率检测。m6A-label-seq的建立为理解m6A在分子水平上的生理作用提供了强有力的工具，并且可以应用于所有m6A motif。烯丙基团标记的效率和时间窗口对于准确鉴定m6A位点至关重要（表2）。
(4) m6A-SAC-seq
m6A选择性烯丙基化学标记和测序（m6A-SAC-seq）是单碱基分辨率绘制全转录组m6A图谱方法之一。这种方法的本质是使用Dim1/KsgA家族的二甲基转移酶酶（MjDim1）在m6A上添加烯丙基SAM化学基团形成烯丙基6m6A，随后在I2处理后发生环化。环化的烯丙基6m6A在逆转录过程中将被read为突变。根据突变reads，可以定量和分析转录组中m6A沉积位点（图1F）。m6A-SAC-seq能够覆盖几乎所有经典的m6A motif，并已应用于检测HeLa、HEK293、HepG2以及造血干细胞（HSC）和单核细胞中的m6A水平。m6A-SAC-seq的初始样本量约为30ng的poly(A)或rRNA耗尽RNA（表2）。
(5) GLORI
类似于RNA m5C的RNA-BisSeq，乙二醛和亚硝酸盐介导的未甲基化腺苷的脱氨（GLORI）也是一种无偏倚、绝对基于化学反应的m6A定量方法。该程序包含三个连续步骤：①使用乙二醛形成可逆结构保护G（N1, N2-二羟基鸟嘌呤加合物）以避免亚硝酸盐诱导的G脱氨；②未甲基化的A通过亚硝酸盐催化的脱氨反应转化为I；③通过碱性或加热条件处理实现G的脱保护（图1G）。GLORI的主要优势是实现RNA中m6A定量分析，但GLORI成本高于m6A MeRIP-seq，且GLORI无法区分m6A和其他一些A修饰，如m6Am和m1A，尽管技术发明者声称已开发出分析流程来消除由m6Am和m1A引起的假阳性（表2）。
(6) eTAM-seq
进化的TadA辅助N6-甲基腺苷测序（eTAM-seq）是一种基于酶促脱氨反应的单碱基分辨率m6A测序方法，用于全转录组范围内定量检测m6A位点。简要来说，使用高活性的tRNA腺苷脱氨酶TadA8.20进行脱氨反应，全局未甲基化的A转化为I，只能与C配对并在随后的逆转录、文库构建和测序过程中被读为G。修饰的m6A保持不变，在测序过程中仍然被读为A。因此，通过eTAM-seq，A被读为G，m6A被读为A。eTAM-seq能够在极少量RNA中（低至10个细胞的RNA）进行m6A的定量检测，其初始RNA需求远低于现有的m6A定量分析方法（图1H）。
(7) TAWO-seq
TET辅助的过钨酸盐氧化测序（TAWO-seq）也是一种 RNA m5C单碱基分辨率测序方法，主要包含三个连续程序，包括由β-葡萄糖转移酶（βGT）标记保护的原始hm5C，由TET酶氧化的原始m5C转化为hm5C，以及由过钨酸盐介导的新生成hm5C的选择性氧化为三羟基胸腺嘧啶（thT）（图2E）。这项技术的最大优势是与RNA-BisSeq相比能够区分m5C和hm5C。
(8) m7G-seq
m7G上的正电荷对NaBH4介导的还原特别敏感。m7G-seq采用NaBH4介导的还原，在m7G位置上产生一个碱性位点，然后这些位点被生物素标记，随后进行生物素下拉实验。在逆转录过程中，RNA中的生物素标记m7G位点会导致错配（主要是T以及其他碱基），从而实现基于这些突变的m7G甲基组的单碱基分辨率（图3C，表2）。
基于酶切反应技术
MAZTER-seq和m6A-REF-seq（m6A敏感的RNA内切核酸酶促进的测序）是同时报道不依赖抗体的方法，用于定量m6A的化学计量分析。这两种方法都依赖于RNA内切核酸酶MazF对ACA motif上的m6A识别，能够在全转录组范围内以单碱基分辨率检测m6A修饰位点及其丰度。MazF在mRNA上更倾向于识别A-CA motif。由于RNA上m6A的motif是RRACH（R=A/G，H=A/C/U），大多数经过MazF酶处理后的读段将在5'端含有ACA，因此内部的(m6A)CA基序被认定为甲基化位点（图1I和J）。然而，这两种方法都受限于内切核酸酶对m6A CA序列的选择性，这使得不包含m6A CA序列的序列无法被识别（表2）。
基于RNA编辑的技术
DART-seq（脱氨基作用邻近RNA修饰靶标测序）是一种不依赖抗体的方法，通过在哺乳动物细胞中表达外源性的APOBEC1-YTH融合蛋白来检测全局m6A修饰位点。其中，YTH（m6A结合域）识别m6A，而连接的APOBEC1（胞嘧啶脱氨酶）直接将胞嘧啶残基上的C编辑为U。这些编辑位点在后续的数据分析中被识别为m6A修饰区域（图1K）。由于YTH结构域与m6A的2'-OH之间的氢键键合是关键结构，DART-seq中的YTH结构域无法识别m6Am。尽管DART-seq能够从低量RNA（约10 ng总RNA）中绘制m6A位点，但需要将APOBEC1-YTH短暂转染入哺乳动物细胞要求限制了其应用，并且可能破坏了生理状态（表2）。
图1：mRNA甲基化测序技术的发展。过去十年m6A测序技术取得快速发展，在单碱基分辨率（约八种类型）和单细胞水平（约三种类型）上取得了突破：包括基于m6A抗体的（A）m6A-seq/MeRIP-seq、（B）miCLIP和（C）PA-m6A-seq；基于化学反应的（D）m6A-SEAL-seq、（E）m6A-label-seq、（F）m6A-SPAC-seq和（G）GLORI、（H）eTAM-seq。
图2：mRNA m5C甲基化测序技术。基于抗体m5C检测方法，包括基于甲基转移酶或其融合标签抗体的技术（A）AZA-seq和（B）m5C miCLIP-seq，以及基于m5C抗体的方法（C）m5C MeRIP-seq。基于化学反应的技术是（D）RNA-BisSeq和（E）TAWO-seq。
表2：RNA甲基化检测技术综述
基于单细胞RNA甲基化检测技术与单细胞组学图谱相比，传统的群体细胞测序方法使用的样本包含成千上万个细胞，因此只能反映群体中的平均甲基化水平。特别是，细胞表达的异质性在很大程度上被掩盖，无法准确反映组织/器官的真实生理或病理特征。目前已经建立单细胞水平的测序技术，用于绘制转录组、染色质开放可及性、DNA甲基化修饰等图谱。报道的单细胞转录组甲基化图谱技术包括scDART-seq和scm6A-seq。
(1) scDART-seq
scDART-seq是在引入10X Genomics单细胞测序后从DART-seq发展而来，是首个单细胞水平的m6A检测方法。通过应用scDART-seq，在成千上万个单细胞中进行m6A图谱分析，发现m6A在单细胞水平上表现出高度异质性，并且可以根据RNA甲基化特征区分细胞亚群，与基因表达水平无关。这些发现揭示以前在bulk-cell m6A分析中被忽视的m6A基本特征，并为理解m6A在不同细胞中的功能提供新见解（图1L）。但由于scDART-seq基于外源基因表达，因此很难应用于组织样本，也无法呈现细胞的原始状态（表2）。
(2) scm6A-seq
通过结合RNA多重标记和MeRIP-seq/m6A-IP，scm6A-seq能够捕获全转录组范围的m6A图谱，并能够在不表达任何外源基因的情况下比较单细胞中的m6A水平。它已被用于区分有核仁包围（SN）和无核仁包围（NSN）的卵母细胞，以单细胞分辨率绘制小鼠卵母细胞发育和合子基因组激活期间的m6A调控机制（图1M，表2）。
(3) picoMeRIP-seq
picoMeRIP-seq也是一种基于m6A抗体的低输入RNA/细胞或单细胞启动的m6A图谱方法。与scm6A-seq相比，picoMeRIP-seq不标记单细胞中的RNA，后续文库构建直接使用商业的SMART-Seq stranded kit（TaKaRa）。在这种方法中，通过系统优化关键步骤提高了m6A/A富集比率，包括增加洗涤剂（SDS）和盐（NaCl）浓度，使用低结合管和商业m6A抗体（Millipore）等（图1N）。picoMeRIP-seq已用于在100 pg poly(A) RNA、单个斑马鱼合子、单个小鼠卵母细胞和植入前胚胎、小鼠胚胎干细胞（1,000、100和10个细胞）的全转录组水平上绘制m6A（表2）。
综上所述，过去十年中RNA甲基化测序技术的快速发展使我们能够更清晰地了解RNA甲基化修饰的分布特征和功能机制。尽管每种技术都有其自身的优势和劣势，但它们可以从多个维度进行补偿或校正，以获得更准确的RNA甲基化位点信息。此外，在单碱基精度和单细胞水平上取得了技术突破，这可以更精细地捕获细胞间RNA甲基化的异质性，并建立单细胞水平的RNA甲基化调控网络。
生物学功能
RNA过程和代谢
作为转录后修饰，RNA甲基化参与RNA代谢的整个过程，如pre-mRNA剪切、mRNA出核、mRNA降解或稳定性以及mRNA翻译。
pre-mRNA剪切
pre-mRNA剪切作为基因表达转录后调控的第一阶段，是去除pre-mRNA中内含子、有序连接外显子以最终生成成熟mRNA的过程。pre-mRNA可变剪切是这一过程中的关键步骤，它可以从一个基因生成多个转录本，为遗传多样性和复杂性做出贡献。m6A去甲基化酶（FTO和ALKBH5）和甲基转移酶复合体（WTAP、METTL3和METTL14）定位于核斑点中，提示m6A在RNA剪切中的潜在作用。FTO优先结合内含子区域pre-mRNA，靠近可变剪切（AS）外显子和聚腺苷酸位点，并调控可变剪切和3′UTR表达。
m6A reader蛋白hnRNPG结合到共转录新生的m6A修饰pre-mRNA，并通过对RNA聚合酶II的互作及其在hnRNPG调控外显子周围的占位影响来调控可变剪切。此外，m6A分布在围绕5′-和3′-剪切位点的外显子区域，并与SRSF1和SRSF2的结合簇空间重叠。在3T3-L1细胞中敲除FTO增强了m6A水平，并促进了SRSF2蛋白的RNA结合能力，该蛋白调控脂肪生成调控因子RUNX1T1的可变剪切和随后的前脂肪细胞分化。同时，有报道称m6A参与依赖其阅读蛋白YTHDC1的pre-mRNA剪切，促进pre-mRNA剪切因子SRSF3（SRp20）而阻止SRSF10（SRp38）进入目标mRNA的结合区域。小鼠卵母细胞中的Ythdc1与pre-mRNA 3′端处理因子（CPSF6、SRSF3和SRSF7）互作，并以m6A依赖方式广泛参与可变聚腺苷酸化和改变3′UTR长度。果蝇中YTH家族蛋白的同源物YT521-B介导依赖于m6A的pre-mRNA可变剪切，并调控果蝇的神经功能和性别决定。Louloupi等人报告称，剪切位点上的m6A沉积促进快速剪切，而内含子中高m6A水平与慢可变剪切相关。有趣的是，m6A开关调控HNRNPC结合活性，其中m6A主导RNA和reader蛋白互作的RNA结构依赖性可及性，促进外显子保守并影响目标mRNA的可变剪切。总的来说，m6A对pre-mRNA成熟过程发挥重要作用，但m5C或m7G是否也参与这一过程尚不清楚。
mRNA出核
mRNA出核是基因表达过程中的关键步骤，mRNA通过这一步骤被转运到细胞质中进行翻译。大多数mRNA出核依赖于转录出核复合体（TREX）和核异二聚体出核受体（NXF1-P15）通路，其中TREX复合体成员被沉积在mRNA上并将其交给NXF1。
YTHDC1通过剪切因子SRSF3和出核接头NXF1促进含m6A的mRNA出核。研究发现多个TREX亚基（ALYREF、UAP56、THOC5、CHTOP）与m6A甲基转移酶复合体（WTAP、METTL3、METTL14、KIAA1429）互作，调控转录本出核。Mettl3在细胞核中显著增加了时钟基因Per2和Arntl的mRNA积累，而细胞中ALKBH5缺失加速了mRNA的RNA出核。同时，HeLa细胞中YTHDC1缺失导致m6A修饰的mRNA核积聚，而在细胞质中缺失。
除了m6A，m5C也在mRNA出核中发挥关键作用。ALYREF不仅是m5C reader蛋白，也是调控核质穿梭的TREX亚基之一。在HeLa细胞中，ALYREF促进含m5C的mRNA出核。3T3-L1细胞中NSUN2的缺乏导致ALYREF-m5C轴介导的CDKN1A mRNA出核减少，导致细胞周期加速和促进脂肪形成。
mRNA降解和稳定性
m6A修饰参与调控mRNA代谢。在野生型mESCs中，Mettl3和Mettl14组成的甲基转移酶复合体在标靶转录本上催化m6A形成，随后阻止与mRNA稳定性相关蛋白HuR的结合，并增强microRNA靶点，导致目标转录本不稳定。YTHDF2是一个经典的m6A reader蛋白，它通过多种通路促进含有m6A的靶转录本降解。首先，Wang等人（2014a）分析了YTHDF2蛋白结构，发现YTHDF2的羧基末端域（C-YTHDF2）选择性地识别含m6A mRNA，而氨基末端域（N-YTHDF2）负责将YTHDF2-m6A-mRNA复合体定位到更专门的mRNA降解机器（如P体等）。其次，哺乳动物细胞中的YTHDF2招募CCR4-NOT脱腺苷酸酶复合体，加速含m6A RNA的脱腺苷酸化和降解。此外，YTHDF2还与HRSP12互作，招募RNase P/MRP复合体（内切核糖核蛋白酶复合体），以切割含m6A的RNA。YTHDF2介导的m6A甲基化mRNA的降解在各种发育和疾病过程中发挥关键作用，如维持造血干细胞功能、在卵母细胞成熟和胚胎发生过程中母源mRNA降解、癌症进展等。
与YTHDF2作用不同，另一个m6A reader蛋白IGF2BPs参与维持稳定性和储存，并在正常和应激条件下影响目标m6A甲基化mRNA基因表达。IGF2BPs介导的m6A修饰mRNA的稳定性参与肿瘤形成。
m5C修饰在mRNA稳定性中也表现出类似的作用。两项平行研究报告称，m5C reader蛋白YBX1通过招募RNA稳定性相关蛋白（HuR或PABPC1a）影响目标mRNA稳定性，并因此参与膀胱尿路上皮癌（UCB）的肿瘤形成和转移，以及斑马鱼胚胎发育。在小鼠Th17细胞中NSUN2缺失以m5C依赖方式导致Il17a和Il17f mRNAs的半衰期和数量减少。
翻译
RNA甲基化已被证明可以促进或抑制翻译过程。在细胞质中，YTHDF1富集在40S核糖体的蛋白质亚基中，并与翻译启动复合体的组成部分eIF3互作，从而促进m6A依赖的mRNA翻译。
YTHDF3也与YTHDF1协同促进蛋白质合成。另一项平行研究也报告称，YTHDF3与YTHDF1合作，通过在翻译过程中顺序招募翻译效应物（40S和60S核糖体亚基）来促进m6A修饰目标mRNA的翻译效率。总体而言，YTHDF1和YTHDF3通过与YTHDF1/YTHDF3链接，在转录本m6A修饰的3'端和40S和60S亚基的翻译效应物的5'端之间形成loop，调控翻译启动。最近的报告还说明了几条分子通路参与YTHDF1或YTHDF3介导的m6A修饰转录本的翻译过程。Zou等人（2023年）报告称，YTHDF1与核糖体蛋白结合以促进其目标mRNA翻译，但FMRP通过阻碍YTHDF1与核糖体蛋白的结合来抑制神经翻译。然而在神经刺激下，FMRP被磷酸化并释放YTHDF1，以提高m6A甲基化mRNA翻译效率，从而促进神经去极化。同时，Chen等人（2023年）已经证明YTHDF1和YTHDF3（不是YTHDF2）携带高水平的营养感应O-GlcNAc修饰，O-GlcNAcylation通过抑制它们与mRNA翻译相关蛋白互作，抑制YTHDF1和YTHDF3的翻译促进功能，导致m6A甲基化mRNA翻译抑制。Chen等人（2023年）还建议不同的细胞在YTHDF1/3上表现出不同的O-GlcNAc修饰水平，这可能是先前研究对YTHDF1/3是否促进m6A RNA翻译功能得出不同结论的原因之一。此外，当m6A位于5'UTR时，它可以通过被43S复合体组分eIF3识别，在细胞应激下促进帽的单独翻译。另一个reader蛋白YTHDC2也以m6A依赖方式增强其靶标翻译效率。尽管如此，Choi等人（2016年）证明，转录本中m6A修饰密码子通过破坏转录本上tRNA的选择导致翻译延伸动态更慢和翻译效率更低。此外，Lin等人（2016年）发现METTL3，而不依赖其m6A催化活性，通过招募eIF3到翻译启动复合体，增强包括重要的癌基因如EGFR和TAZ在内的目标mRNA翻译，导致人类肺癌细胞的生长、存活和侵袭得到促进。
m5C广泛分布在rRNA和tRNA变区和反密码loop上，通过调控tRNA稳定性和密码子识别、翻译保真度和准确性或全局蛋白质合成等参与翻译调控。mRNA上的m5C也参与调控翻译效率，在3T3-L1细胞中，NSUN2以m5C依赖的方式促进CDKN1A mRNA的翻译效率。在大鼠的T淋巴细胞中，NSun2介导的m5C修饰在高同型半胱氨酸血症诱导下促进IL-17A mRNA的翻译。此外，NSUN6特异性m5C位点富集在3'UTR中的CTCCA motif上，与翻译终止保真相关。然而，Tang等人（2015年）报告称NSun2通过在p27 mRNA的5'UTR上的胞嘧啶C64上甲基化，抑制p27翻译，表明mRNA上m5C位点可能决定其对翻译效率的调控效应。
真核mRNA的5'帽上m7G已被证明参与翻译调控。最近的研究还表明，mRNA内部的m7G修饰在mRNA翻译通路中起作用。METTL1组装的内部m7G修饰能够促进m7G修饰转录本翻译效率，而不依赖于其对全局翻译和tRNA甲基化的影响。内部m7G在人类mRNA沿的表现显示在翻译起始位点保守富集，而在H2O2或热休克处理下在CDS和3'UTR区域显著积累，促进mRNA翻译效率。此外，METTL1介导的m7G甲基化增强VEGFA mRNA翻译，促进人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的血管生成。
综上所述，RNA甲基化修饰在包括pre-RNA处理、mRNA代谢和翻译在内的整个mRNA表达过程中发挥重要作用，凸显其生物学意义。Li等人（2017c）证明METTL3/METTL14介导的m6A和NSUN2介导的m5C甲基化在p21 3'UTR中协同增强p21翻译，在氧化应激诱导的细胞衰老中导致p21表达升高，表明多种RNA甲基化修饰可能协同调控同一生物学事件。然而，仍然需要揭示这些修饰单独或协同调控mRNA表达过程的更多调控机制，这将有助于描绘多种RNA甲基化的调控网络。
哺乳动物发育
配子发生
一系列最新研究表明，RNA甲基化表观转录组在精子发生和卵子发生中扮演着至关重要的角色。Guo等人（2022年）通过LC-MS/MS分析发现，多种RNA修饰（如m5C、m3C、m7G、m2G、m22G、m1G和m1A）分布在人类精子的RNA中，这些修饰在弱精子症（AZS）和畸精子症（TZS）组中的水平显著高于正常精子症（NZS）组，特别是在TZS组中m5C和m6A的水平更高。在精子发生过程中，m6A作为一个重要的调控因子，参与哺乳动物精原细胞的有丝分裂、减数分裂和精子形成。Mettl3介导的m6A调控精原干细胞（SSCs）的增殖和分化，并影响减数分裂的启动。在雄性生殖细胞中敲除METTL3或METTL14会导致睾丸组织中SSCs快速耗竭甚至完全缺失。人类精子中METTL3上调导致m6A水平增加，进而增强精子运动能力，这是弱精子症的一个风险因素。此外，小鼠支持细胞特异性敲除Wtap会损害SSCs的自我更新和增殖能力，最终导致不育，通过干扰Wtap介导的m6A修饰基因的可变剪切。此外，ALKBH5介导的小鼠精原细胞和圆形精子细胞核中的m6A参与正确剪切和较长3'UTR mRNAs生成，这是精子发生的晚期减数分裂和单倍体阶段所必需的。敲除FTO会导致GC-1精原细胞系的染色体不稳定和G2/M阶段转换抑制。在小鼠中，Ythdc2在雄性或雌性生殖细胞中敲除导致异常的配子减数分裂，导致不育和睾丸及卵巢体积减小。同时，小鼠减数分裂细胞中条件性敲除Ythdc2导致转录组严重失调，包括编码微管网络蛋白的转录本，并导致减数分裂细胞和精原细胞在晚期减数分裂阶段的端粒聚集和凋亡。成年雄性小鼠Ythdc1缺陷导致缺乏任何生殖细胞，包括有丝分裂精原细胞，并表现出仅支持细胞的表型。在小鼠精原细胞中敲除Ythdf2通过m6A/mRNA降解通路下调基质金属蛋白酶表达，并影响细胞粘附和精原细胞增殖。此外，敲除m5C甲基转移酶NSun2对精原干细胞和支持细胞没有影响，但抑制了生殖细胞进入减数分裂的减数分裂阶段。
在卵子发生过程中，METTL3介导的m6A通过促进母源mRNA翻译效率对小鼠卵母细胞成熟是必需的。在卵母细胞的生殖泡（GV）阶段敲低Mettl3严重抑制卵母细胞的减数分裂成熟。同时，Yao等人（2023年）证明METTL3催化的m6A沉积促进了GV期卵母细胞中m6A修饰RNA降解。然而，Mu等人（2021年）报告称METTL3靶向Itsn2进行m6A修饰，随后增强其在GV阶段的稳定性，以促进卵母细胞发育过程中减数分裂的恢复。此外，母源YTHDF2负责以m6A依赖方式指导适当的母源转录本剂量，从而决定哺乳动物卵母细胞质量和雌性生育能力。卵母细胞中Ythdc1缺陷导致m6A依赖的可变剪切缺陷，导致卵母细胞成熟停滞和雌性不孕。在卵母细胞中特异性敲除KIAA1429导致GV期卵母细胞中m6A修饰RNA的异常代谢，导致GV卵母细胞无法进行生殖泡破裂（GVBD）和随后失去恢复减数分裂能力。此外，卵巢中Nsun5缺失导致m5C在mRNA外显子和3'UTR区域的时间依赖性下降，影响减数分裂阻滞缺陷2样2（MAD2L2）的mRNA稳定性、生长分化因子9（GDF9）的翻译效率、以及Brd8外显子区域的异常可变剪切，导致卵泡发育和卵巢功能障碍。有趣的是，NSUN2在人类和小鼠MI/MII期卵母细胞的细胞质中表达，可能促进NSUN2蛋白与母源mRNAs互作，并催化m5C形成。卵母细胞中m5C修饰转录本的逐渐增加和沉积可能在早期胚胎发生中起作用。
早期胚胎发育
RNA甲基化修饰在胚胎发育中发挥重要作用。在体外，小鼠GV期卵母细胞中METTL3缺失会阻碍受精后胚胎发育中的母系到合子转变（MZT）和合子基因组激活，可能是通过破坏母源mRNA降解。小鼠胚胎4细胞阶段的转录因子mRNA上，如Cdx2、Nanog、Sox2和Pou5f1的m6A修饰，可能参与调控合子基因激活（ZGA）过程。m6A reader蛋白YTHDF2在母源上是必需的，对于卵母细胞的能力和早期MZT过程，具有清除m6A修饰的母源mRNA作用。由METTL3依赖的m6A甲基化调控的HnRNPA2/B1在着床前胚胎发育期间在核和细胞质中表达，其功能缺陷会延缓4细胞阶段后的胚胎发育，并通过对胚泡中多能性的调控影响内细胞团（ICM）的形成。斑马鱼胚胎发生中的m5C reader蛋白YBX1招募Pabpc1a来维持m5C修饰的母源mRNA稳定性，促进有序的MZT过程。
对于小鼠胚胎干细胞（mESC），Wang等人报告称m6A甲基化对于维持mESC在其基础状态至关重要，Mettl3或Mettl14缺失会导致mESC失去自我更新能力，这是由于HuR-microRNA和m6A介导的RNA稳定性通路功能障碍。Zc3h13靶向核中的WTAP、Virilizer和Hakai的成分复合体上，催化m6A形成，然后促进mESC自我更新。Batista等人（2014年）证明小鼠和人类ESC中Mettl3缺失降低了m6A修饰水平，延长分化时Nanog表达，导致促进mESC自我更新和抑制mESC分化。此外，Mettl3介导的m6A甲基化维持多能性因子保真和及时下调，调控小鼠原始多能性解决过程中适当的谱系启动和分化。Mettl14介导的m6A调控mRNA表达和可变剪切，并进一步转换为原始多能性到启动多能性和外胚层分化的小鼠胚胎。更重要的是，METTL14缺失在E6.5和E7.5（胚胎日）导致严重的生长迟缓和异常形态。
免疫系统发育
免疫细胞起源于造血干细胞（HSCs）分化，其命运对整个免疫系统至关重要。越来越多的证据支持RNA甲基化从多个角度调控HSCs。斑马鱼胚胎中Mettl3缺失抑制了最早的HSPCs生成，通过破坏YTHDF2介导的动脉内皮基因 notch1a 和 rhoca 的m6A依赖性mRNA衰变。与斑马鱼中的功能一致，Mettl3-m6A-YTHDF2-Notch轴通路在小鼠HSPCs生成和明确的造血中也显示出不可或缺和保守的功能。小鼠中阶段特异性的Mettl3缺失导致HSCs积累，并因未能通过METTL3介导的m6A甲基化上调MYC表达而阻止HSC分化。Cheng等人（2019b）还证明m6A通过调控MYC mRNA稳定性维持HSC对称。同时METTL14在正常髓系造血过程中表达下调，并通过正向调控MYB和MYC mRNA稳定性和翻译，基于m6A方式促进HSPCs向髓系细胞分化。Ythdf2缺失通过促进与干细胞自我更新相关的转录因子m6A介导的mRNA稳定性，促进HSPCs和人类脐带血（hUCB）HSCs扩增。Mapperley等人（2021年）还报告称，造血特异性Ythdf2缺失导致m6A修饰和炎症反应相关转录本上调，并激活促炎通路，导致淋巴潜能丧失，随后髓系偏向和HSC扩增。并且老化的Ythdf2缺失HSCs导致多系造血重建失败。
RNA甲基化通过调控免疫相关基因的转录本代谢参与先天免疫。在巨噬细胞中，SOCS1作为SOCS家族蛋白之一，参与巨噬细胞激活的负反馈回路，通过促进目标信号蛋白的多泛素化和蛋白酶体降解，以防止压倒性的全身炎症，其在巨噬细胞中对感染的响应依赖于METTL14-m6A-YTHDF1轴。METTL3缺失导致m6A介导的mRNA稳定性和Irakm高表达，最终抑制TLR（Toll样受体）信号介导的巨噬细胞激活。树突状细胞（DCs）作为连接先天和适应性免疫反应的专业抗原呈递细胞（APCs），对启动适应性免疫反应、消除入侵病原体和维持免疫稳态至关重要。Mettl3催化的mRNA m6A甲基化增强了CD40、CD80和TLR4信号接头Tirap翻译，并促进DC激活和TLR4/NF-κB信号诱导的细胞因子产生。此外，NK细胞中的Ythdf2对IL-15/STAT5信号介导的NK细胞存活、增殖和效应功能是必需的，促进NK细胞的抗肿瘤和抗病毒免疫活性。小鼠肿瘤模型中Mettl3缺失下调m6A甲基化基因SHP-2表达，可能导致NK细胞对IL-15刺激应答降低，并抑制NK细胞在肿瘤微环境中的浸润和功能。
除了先天免疫，RNA甲基化还参与调控适应性免疫反应。Mettl3介导SOCS家族蛋白SOCS1、SOCS3和CISH的m6A形成及其随后的降解，降低了SOCS家族活性，从而促进IL-7介导的STAT5激活和naïve T细胞的稳态增殖和分化。在Tregs中敲除Mettl3/m6A增加了Socs mRNA表达，从而抑制IL-2-STAT5信号通路，维持Tregs抑制功能。Th17细胞敲除METTL3可以促进SOCS3 mRNA稳定性，从而抑制IL-17A和CCR5表达，破坏Th17细胞分化和浸润。METTL3介导的m6A稳定Tcf7转录本，允许正常产生TCF-1蛋白及其调控的T滤泡辅助（Tfh）细胞调控因子，促进了Tfh细胞分化、增殖和功能成熟。T细胞特异性敲除ALKBH5增强了CD4+ T细胞中m6A修饰水平，并下调Cxcl2和Ifng的mRNA稳定性和蛋白表达，导致CD4+ T细胞功能和中性粒细胞招募在自身免疫期间受到抑制。
与m6A相比，关于其他RNA甲基化修饰在免疫细胞中的功能机制的研究相对较少。在高同型半胱氨酸血症（HHcy）诱导的大鼠慢性炎症疾病模型中，NSun2通过催化m5C形成及其在T淋巴细胞中促进翻译来介导IL-17A表达上调。Yang等人（2023年）还发现NSun2特别与Th17细胞转录因子RoRγt结合，催化其靶标上的RNA m5C形成，包括Il17a和Il17f，从而增强其mRNA稳定性。小鼠CD4+ T细胞中Nsun2缺失特别抑制了Th17细胞分化，并缓解Th17细胞诱导的结肠炎发病机制。在系统性红斑狼疮（SLE）患者的CD4+ T细胞中，Nsun2表达和m5C修饰水平下调，高甲基化m5C转录本主要参与mRNA剪切、稳定和翻译的细胞因子相关信号通路，而低甲基化m5C转录本主要参与翻译延伸。
总的来说，RNA甲基化修饰广泛参与生物体的发育过程，并在配子发生、胚胎发生以及胚胎后神经和免疫系统发育等多个功能通路中发挥关键作用。目前，m6A在发育研究中的关注度比其他修饰更多。随着检测技术的进步和各种RNA甲基化调控因子的鉴定，其他甲基化修饰在发育中的功能分析也可能变得有价值。
癌症
目前，已有数百项研究证明RNA甲基化通过直接作用或其调控元件参与包括癌症在内的多种疾病发生和发展的调控。以下仅总结一些最新的（过去五年）和尖端的关于肿瘤发生中RNA甲基化修饰的研究。越来越多的证据表明m6A失调驱动异常的转录和翻译程序，并随后促进疾病或肿瘤的发生和进展，如白血病、肝细胞癌（HCC）、肺癌（LC）、结直肠癌（CRC）、乳腺癌、膀胱癌（BC）、胰腺癌（PC）、胃癌（GC）、胶质母细胞瘤。m6A在癌细胞代谢中发挥重要作用，包括通过调控代谢相关通路，如mTOR、PTEN、MAPK、NF-κB、Wnt信号通路等，或转录因子，如HIF-1、FOXM1、cMyc、YAP。m6A还参与重塑各种肿瘤免疫，通过调控免疫细胞的生存或功能，包括B细胞、CD8+ T细胞、CD4+ T细胞、PD-1+ T细胞、Treg细胞、NK细胞、DC细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和CD4+记忆激活T细胞的浸润，以及免疫相关细胞因子的表达，如FN-γ、CXCL9和CXCL10。总体而言，m6A影响肿瘤发生和转移、代谢、免疫逃逸，在诊断和治疗方面具有潜在价值。
m5C调控因子，如NSUN2的甲基转移酶和YBX1的reader蛋白，在肿瘤组织中高表达。m5Cs在肿瘤组织中也经常出现高甲基化，并在致癌通路中富集。NSUN2和YBX1在UCB中靶向HDGF基因3'UTR的m5C，调控HDGF mRNA稳定性并促进UCB发病机制。丙酮酸激酶肌肉同工酶M2（PKM2），作为一种限速的糖酵解酶，参与肿瘤代谢和生长，其mRNA的3'UTR含有m5C位点。ALYREF直接识别PKM2 mRNA并以其m5C依赖性方式促进其稳定性，从而促进糖酵解和膀胱癌的肿瘤发生。类似的研究还表明，NSUN2介导的食管鳞状细胞癌（ESCC）中的m5C高甲基化通过增强LIN28B依赖的GRB2 mRNA稳定性，激活致癌的PI3K/AKT和ERK/MAPK信号，促进ESCC的起始和进展。NSUN2通过以m5C依赖方式上调TEAD1增强下咽鳞状细胞癌（HPSCC）的增殖和侵袭。在HCC中，NSUN2介导的m5C修饰在HCC中明显高于相邻非癌组织。m5C通过抑制Ras通路活性并增加HCC细胞对索拉非尼的敏感性来调控HCC进展，并且m5C修饰的lncRNA H19招募G3BP1致癌蛋白促进HCC发生和发展。此外，蛋白质翻译后修饰通过修饰RNA甲基化reader蛋白参与调控m5C靶标，并影响肿瘤发生。SIAH1通过泛素化和降解YBX1间接促进m5C修饰RNA不稳定性，抑制上皮卵巢癌细胞的增殖、侵袭、迁移和药物抗性。
几项研究表明m7G tRNA修饰影响癌症进展。METTL1/WDR4敲除破坏m7G tRNA解码密码子形成，降低mRNA翻译效率并抑制肺癌、HCC、BC和鼻咽癌（NPC）进展。METTL1介导的HeLa细胞中mRNA内部m7G也增强其靶标mRNA的翻译效率，而不依赖其对全局翻译和tRNA甲基化的影响。METTL1催化的人类脐静脉内皮细胞中VEGFA mRNA上的m7G组装增加了VEGFA翻译，并促进缺血后血管生成。这些研究表明内部m7G可能参与癌症进展。
总体而言，RNA甲基化修饰在肿瘤发生过程中发挥着关键作用，但不同修饰是否在肿瘤发生中协同或拮抗作用值得进一步研究。此外，尽管许多由RNA甲基化修饰调控的靶标和通路具有肿瘤诊断和治疗的潜力，但实际应用于临床设置很少，需要进一步深入研究以促进临床应用。
结论与展望
本文总结了包括m6A、m5C和m7G在内的三种甲基化表观转录组的调控元件、分布特征、检测技术以及生物学功能。由于RNA甲基化修饰在调控多种生理功能中的参与，主要概述了几个热点话题，包括配子发生、早期胚胎发生、免疫系统发育和疾病。尽管m6A和m5C RNA修饰的调控元件已经被发现并广泛研究，但关于其他RNA甲基化修饰的信息相对较少，特别是其erasers和readers需要确定。随着对其他RNA甲基化修饰动态性质的调控元件和机制的深入研究，对其功能机制的更清晰理解将有助于建立整体RNA表观遗传修饰调控网络。
尽管已经开发了各种RNA甲基化修饰的测序技术，但它们中的大多数只能很好地捕获和分析高丰度而不是低丰度转录本中的修饰信息，而后者将是一个有意义的突破点。此外，越来越多的研究表明RNA甲基化修饰参与多种生物过程和肿瘤发生。然而，几乎所有的研究都是在群体细胞水平上进行的，这可能会忽视或扭曲单个细胞中的真实信息，限制对精确调控机制的理解，这对于指导疾病的精确靶向治疗可能至关重要。因此，开发高通量单细胞RNA甲基化技术应该是该领域的创新点和推动力。此外，几项研究也表明多种RNA甲基化修饰可能共同调控某些生物过程。因此，探索不同RNA修饰之间的相互调控关系可能是未来的一个热点话题，这对于构建整体RNA表观遗传修饰调控网络是必要的。目前能够同时捕获多种修饰的测序技术仍然相对较少，修饰类型的覆盖范围和灵敏度仍需改进。因此，开发新技术以同时检测多种RNA表观遗传修饰是理解生物系统中整体作用模式的必要条件。
从文章的疾病部分来看，RNA表观遗传修饰及其调控因子在各种肿瘤的增殖、侵袭和迁移中发挥重要作用。此外，多个RNA甲基化修饰基因或其通路已被报道作为诊断或治疗的潜在靶标，但其目前的临床应用仍然非常有限。因此，需要加强特定RNA甲基化修饰抑制剂的研究，这可能是实现RNA甲基化修饰临床转化应用的关键点，尽管已有一些抑制剂的报道，如FTO抑制剂、Meclofenamic酸、FB23/FB23-2、MA2、Entacapone、DAC51、R-2HG、CS1/CS2、METTL3抑制剂（包括Compound 2/Compound 7）、STM2457、YTHDF2抑制剂（包括DC-Y13-27）和IGF2BP1抑制剂（包括BTYNB）。此外，几项研究表明RNA甲基化修饰可以用于靶向编辑。在细胞水平上，表达与截短的METTL3甲基转移酶结构域融合的核定位dCas13，与修饰的METTL3-METTL14甲基转移酶复合体和特定导向RNA融合的细胞质定位，有能力在mRNA中将特定位点的腺苷修饰为m6A。Liu等人（2019b年）还设计了一个m6A动态编辑系统，将CRISPR-Cas9与单链m6A甲基转移酶METTL3:METTL14融合以在特定位点编程m6A形成，同时将CRISPR-Cas9与ALKBH5或FTO融合以实现RNA的位点特异性去甲基化。然而，这些技术都是基于细胞内编辑相关蛋白的表达，使得直接治疗如人类肿瘤等疾病变得困难，而其他RNA甲基化的RNA编辑技术大多未知。此外，考虑到RNA甲基化修饰对mRNA代谢和翻译有显著影响，研究体外RNA甲基化靶向编辑技术对于增强mRNA药物的效力具有重要意义。
总之，对RNA甲基化修饰的调控蛋白组分、测序技术、功能机制、抑制剂和靶向编辑技术的深入研究将提供关于RNA甲基化修饰在生物发育和疾病发生中功能角色的广阔视野，对于疾病诊断和治疗也具有宝贵的视角。
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