液体活检应用“Crystal Digital PCR”高阶多重技术进行泛癌突变检测

液体活检作为一种新兴的癌症诊断和监测技术，主要样本类型包括全血、血浆、胸腔积液、腹腔积液、尿液、脑脊液以及唾液等。该技术在肿瘤的早期筛查、早期诊断、治疗监测及预后评估等多个环节展现出巨大潜力，有望为肿瘤全周期的诊断和治疗提供解决方案。

01 液体活检现有的挑战

Fig. 1 液体活检示例

1.1 需要灵活多样的检测方法
液体活检技术能够提供一系列丰富的生物标志物，包括循环游离DNA（cfDNA）、循环游离RNA（cfRNA）以及甲基化DNA等，需要灵活多样的检测方法对这些标志物进行深入的检测与分析。

1.2 需要更高灵敏度
循环肿瘤DNA（ctDNA）的浓度在不同个体和肿瘤类型中表现出显著的差异性，最小等位基因频率（Minor Allele Frequency, MAF）跨度从0.1%到10%。鉴于这种广泛的浓度差异，为了准确捕捉和分析这些微小的遗传变化，对检测则需要更高的灵敏度。

1.3 需要覆盖更多的检测信息
液体活检的样本弥足珍贵，因此在检测过程中，希望利用最小的样本量来尽可能的获取更丰富的样本检测信息。

02 Crystal Digital PCR^®为液体活检提供精准便捷的解决方案

Fig. 2 Crystal Digital PCR^®的工作流程

2.1 让基因突变检测更加简单高效
全流程时间（Total Time of Testing, ToT）仅需3小时，即可全面覆盖各类基因突变，检测灵敏度达0.1%。同时，检测方案兼具多重检测的高效性和超高性价比。操作流程简洁明了，单一设备、单一耗材，单次加样，极大简化了检测过程。

Fig. 3  Crystal Digital PCR^®基因突变检测

2.2 提供两种检测策略满足不同检测需求
针对大规模样本检测：例如，在检测ESR1基因时，采用Ruby芯片，能够实现单次检测384个样本，提供高样本通量解决方案。

针对多基因组合检测：单个样本检测，能够同时检测超过100种基因靶标，实现高效的多重基因检测。

Fig. 4  Crystal Digital PCR^®两种检测策略

2.3 对低浓度、稀有突变有高灵敏检出(MAF 0.05%)
在常规条件下，液体活检样本的浓度通常为0.5至3ng/ul。测试样本浓度分别为0.4ng/ul、0.8ng/ul和1.75ng/ul，对应的最小等位基因频率（MAF）覆盖了从0%到2%，包括0.05%、0.1%、0.5%、1%等关键点。无论样本浓度如何，都能够实现至少0.05%最小等位基因频率（MAF）高灵敏度检测，并且在低浓度样本中也展现出卓越的重复性和稳定性。

Fig. 5  BRAF,KRAS,NRAS突变检测结果

2.4 Crystal高阶多重技术确保了多重靶标检测结果的一致性
7色荧光*，可实现单孔高达21种靶标的多重检测。结合软件的自动化分析，有效降低了荧光信号间的干扰，使得单次检测能够提供更为丰富和精确的信息。

采用荧光多重组合，ESR-1突变检测试剂实现了对18个靶标（17种ESR-1突变靶标和1个参考基因靶标）的高效检测。检测结果表明，与较低多重检测方法相比，高阶多重检测展现了良好的结果一致性和MAF相关性。

Fig. 6  ESR-1高阶多重检测结果

“所见即所得”——可视化质控系统能够全面追踪微滴的数量、分布和体积，软件自动化功能有效识别并排除假阳性微滴，从而大幅提升检测结果的可信度和可靠性。在三次重复实验中，我们以0.05%的变异等位基因频率（VAF）成功确认了Y537N突变的存在。.

Fig. 7 ESR-1 Y537N 0.05%的变异等位基因频率(VAF)

2.5 与NGS比有更高的灵敏性和精准性
对于低MAF的样本，Crystal Digital PCR^®比下一代测序（NGS）展现出更高的灵敏性和定量精准性。

Fig. 8  ESR-1 D538G dPCR对比NGS检测结果

2.6 Flex探针技术极大降低荧光串扰及开发成本

Fig. 9  通用荧光报告系统

通用荧光报告系统由两部分组成——引物和通用报告基团。与Taqman探针系统相比，通用荧光报告系统在不同检测panel的研发与生产过程中，无需合成新的探针，从而大幅节省了研发和生产成本。

03 Crystal Digital PCR^®系统提供的解决方案及其卓越价值

• Crystal Digital PCR^®实现对低浓度样本和稀有突变的高灵敏度检测。

• Crystal Digital PCR^®的超高通量检测最大程度地从珍稀样本中提取更丰富的样本信息。

• Crystal Digital PCR^®简化的工作流程和最少的操作时间，显著降低了实验的可变性。

• Crystal Digital PCR^®的灵活样本通量使您能够选择合适的技术，以达到所需的灵敏度和精准度。

• 相较于其他技术或dPCR系统，Crystal Digital PCR^®在液体活检应用中极大的节约检测时间和成本。