Nature最新研究成果：内源性肽维持中枢神经系统的免疫豁免机制
本期PEAKS用户文章我们分享一篇来自顶刊Nature最新的免疫肽研究工作。
圣路易斯华盛顿大学脑免疫与神经胶质中心的Jonathan Kipnis等人，在10月30号发表“Endogenous self-peptides guard immune privilege of the central nervous system”的论文，该研究发现了一系列中枢神经系统衍生的内源性自身多肽，这些肽与CNS边缘的MHC-II分子结合。
此外，作者发现在神经炎性疾病中，自身多肽的表达减少。在增强这些自身多肽的表达后，抑制性CD4+T细胞的数量显著增加，通过CTLA-4和TGFβ免疫分子来抑制CNS自身免疫。因此，这些多肽应该是CNS与外周免疫系统保持信息交流的关键分子。人们普遍认为，大脑将自身与外周免疫系统隔离开来，而作者的发现，为神经炎症和神经退行性疾病的治疗提供了新的思路。本研究中质谱数据分析使用PEAKS® Studio完成。
CNS的自生MHC II免疫肽组分析
作者首先通过质谱法对C57BL/6J雄鼠的CNS不同组织中富集的MHC II类多肽进行全面鉴定（图1a），发现CD11b+ CD11c-巨噬细胞是脑膜和硬脑膜组织中主要表达MHC II的抗原呈递细胞（APCs），而CD19+B细胞是颈深淋巴结（dCLNs）和颈浅淋巴结（sCLNs）中的主要APCs。此外，利用三种独立的模型对MHC II结合亲和力的算法预测[1-3]发现，大脑内部的 MHC II分子的结合亲和力相对较弱，然而，在淋巴引流的下游，结合亲和力增加，这表明不同区室中的MHC II分子与免疫多肽的结合存在异质性。
然后，作者通过已发表的哺乳动物脑转录组数据区分来鉴别CNS中表达较多的蛋白质的衍生肽段。结果发现大脑中脑膜、硬脑膜、dCLNs和sCLNs的MHC II多肽分别占比18.0%、12.7%、2.5%和0.5%的MHC II结合肽（图1b）。其中，前三种组织中的MHC II肽大部分源自髓鞘碱性蛋白（MBP），但sCLNs中未匹配到该蛋白（图1c）。通过不同组织间的免疫肽比较发现，dCLNs是体内平衡过程中脑部淋巴引流的主要途径（图1d）。此外，对在大脑、硬脑膜和dCLNs中发现的MBP肽的氨基酸序列进行比对，发现大部分多肽均出现在MBP158-195和MBP196-236两个区域（图1e），且绝大多数MHC II结合的MBP多肽分布在MBP158-195区间。
然后作者又对C57BL/6J雌鼠和SJL/J雄鼠中重复上述实验，结果表明C57BL/6J的雌鼠和雄鼠间均鉴定到相当数量的CNS特异性免疫肽。SJL/J雄鼠中的MHC II肽在脑内的结合亲和力相对较弱，而在引流淋巴结中的亲和力较强，且在大脑和硬脑膜组织中也鉴定到相同的MBP158-195和MBP196-236区域对应的多肽。因此上述实验充分表明了MBP衍生肽在CNS MHC II分子上的保守性。
图1 小鼠脑组织MHC II多肽鉴定
MBP多肽抑制免疫反应
图2 MBP多肽免疫抑制机制MBP多肽的治疗效果
图3 MBP多肽胞外囊泡治疗效果评估小结
联系方式：021-60919891；sales-china@bioinfor.com
圣路易斯华盛顿大学脑免疫与神经胶质中心的Jonathan Kipnis等人，在10月30号发表“Endogenous self-peptides guard immune privilege of the central nervous system”的论文，该研究发现了一系列中枢神经系统衍生的内源性自身多肽，这些肽与CNS边缘的MHC-II分子结合。
此外，作者发现在神经炎性疾病中，自身多肽的表达减少。在增强这些自身多肽的表达后，抑制性CD4+T细胞的数量显著增加，通过CTLA-4和TGFβ免疫分子来抑制CNS自身免疫。因此，这些多肽应该是CNS与外周免疫系统保持信息交流的关键分子。人们普遍认为，大脑将自身与外周免疫系统隔离开来，而作者的发现，为神经炎症和神经退行性疾病的治疗提供了新的思路。本研究中质谱数据分析使用PEAKS® Studio完成。
CNS的自生MHC II免疫肽组分析
作者首先通过质谱法对C57BL/6J雄鼠的CNS不同组织中富集的MHC II类多肽进行全面鉴定（图1a），发现CD11b+ CD11c-巨噬细胞是脑膜和硬脑膜组织中主要表达MHC II的抗原呈递细胞（APCs），而CD19+B细胞是颈深淋巴结（dCLNs）和颈浅淋巴结（sCLNs）中的主要APCs。此外，利用三种独立的模型对MHC II结合亲和力的算法预测[1-3]发现，大脑内部的 MHC II分子的结合亲和力相对较弱，然而，在淋巴引流的下游，结合亲和力增加，这表明不同区室中的MHC II分子与免疫多肽的结合存在异质性。
然后，作者通过已发表的哺乳动物脑转录组数据区分来鉴别CNS中表达较多的蛋白质的衍生肽段。结果发现大脑中脑膜、硬脑膜、dCLNs和sCLNs的MHC II多肽分别占比18.0%、12.7%、2.5%和0.5%的MHC II结合肽（图1b）。其中，前三种组织中的MHC II肽大部分源自髓鞘碱性蛋白（MBP），但sCLNs中未匹配到该蛋白（图1c）。通过不同组织间的免疫肽比较发现，dCLNs是体内平衡过程中脑部淋巴引流的主要途径（图1d）。此外，对在大脑、硬脑膜和dCLNs中发现的MBP肽的氨基酸序列进行比对，发现大部分多肽均出现在MBP158-195和MBP196-236两个区域（图1e），且绝大多数MHC II结合的MBP多肽分布在MBP158-195区间。
然后作者又对C57BL/6J雌鼠和SJL/J雄鼠中重复上述实验，结果表明C57BL/6J的雌鼠和雄鼠间均鉴定到相当数量的CNS特异性免疫肽。SJL/J雄鼠中的MHC II肽在脑内的结合亲和力相对较弱，而在引流淋巴结中的亲和力较强，且在大脑和硬脑膜组织中也鉴定到相同的MBP158-195和MBP196-236区域对应的多肽。因此上述实验充分表明了MBP衍生肽在CNS MHC II分子上的保守性。
图1 小鼠脑组织MHC II多肽鉴定
MBP多肽抑制免疫反应
为了进一步筛选MBP衍生的多肽，作者分别使用MOG35-55（髓鞘少突胶质细胞糖蛋白）和MBP160-175的多肽免疫C57BL/6J小鼠，结果正如预期，即MBP160-175免疫的小鼠对自身免疫性脑脊髓炎（EAE）表现出抵抗力（图2a）。与被MOG35-55免疫的小鼠相比，MBP160-175免疫的小鼠的引流淋巴结中细胞数量明显减少，且再ELISpot实验中，MBP160-175对IL-2也未发现明显的效应T细胞反应（图2b-c)。基于以上结果，作者进一步探索MBP158-195区域内的多肽是否有助于产生更多的抑制性T细胞，从而抑制免疫反应。用MOG35-55肽和内源性MBP肽共同免疫小鼠，结果显示MOG35-55+MBP160-175联合免疫可显著减轻EAE症状（图2d）。然后将MBP160-175序列中的精氨酸残基转化为瓜氨酸，再次于MOG35-55共同免疫小鼠时，不再具有抑制作用，这表明MBP160-175具有独特的神经炎症免疫调节功能（图2d）。
接下来作者重点研究了MBP160-175的潜在免疫抑制机制，分别从MOG35-55和MOG35-55+ MBP160-175免疫后的小鼠腹沟引流淋巴结（iLNs）中分离出163个T细胞，然后进行10X Genomics单细胞RNA测序（scRNA-seq），结果差异基因表达可分辨出CD4+和CD8+T细胞的15个不同的细胞簇（图2e）。其中，调节性Foxp3+CD4+ T细胞和活化的Cxcr3+Ccl5+CD8+T细胞表现出明显差异，这两种细胞在自身免疫性疾病中发挥重要作用。当MOG35-55 + MBP160-175联合免疫时，调节性Foxp3+CD4+ T细胞显著增加，而Cxcr3+Ccl5+CD8+T细胞群明显衰减（图2f），表明MOG35-55 + MBP160-175的上游调控，如T细胞活化和增殖的负调控以及促进抑制性细胞因子（IL-10和TGF-β）的产生（图2g-i）。MBP160-175免疫小鼠的脊髓中CD39表达显著增加，这表明其通过消耗细胞外的ATP来增强抗炎活性（图2j,k）[4]，并且在疾病消退期间持续存在。
然后作者合成了MBP特异的MHC II聚合物，通过杂交瘤接种C57BL/6J小鼠，成功地鉴定了位于dCLNs内的MBP特异性CD4+T细胞，sCLNs和iLNs中未鉴定到（图2l）。因为CTLA-4和TGFβ具有良好的免疫抑制作用[5,6]，作者又测试了它们与MBP共同免疫时，对EAE的抑制效果，结果发现CTLA-4或TGFβ的中和抗体削弱了MBP对 CNS自身免疫反应的抑制能力（图2m，n）。
接下来作者重点研究了MBP160-175的潜在免疫抑制机制，分别从MOG35-55和MOG35-55+ MBP160-175免疫后的小鼠腹沟引流淋巴结（iLNs）中分离出163个T细胞，然后进行10X Genomics单细胞RNA测序（scRNA-seq），结果差异基因表达可分辨出CD4+和CD8+T细胞的15个不同的细胞簇（图2e）。其中，调节性Foxp3+CD4+ T细胞和活化的Cxcr3+Ccl5+CD8+T细胞表现出明显差异，这两种细胞在自身免疫性疾病中发挥重要作用。当MOG35-55 + MBP160-175联合免疫时，调节性Foxp3+CD4+ T细胞显著增加，而Cxcr3+Ccl5+CD8+T细胞群明显衰减（图2f），表明MOG35-55 + MBP160-175的上游调控，如T细胞活化和增殖的负调控以及促进抑制性细胞因子（IL-10和TGF-β）的产生（图2g-i）。MBP160-175免疫小鼠的脊髓中CD39表达显著增加，这表明其通过消耗细胞外的ATP来增强抗炎活性（图2j,k）[4]，并且在疾病消退期间持续存在。
然后作者合成了MBP特异的MHC II聚合物，通过杂交瘤接种C57BL/6J小鼠，成功地鉴定了位于dCLNs内的MBP特异性CD4+T细胞，sCLNs和iLNs中未鉴定到（图2l）。因为CTLA-4和TGFβ具有良好的免疫抑制作用[5,6]，作者又测试了它们与MBP共同免疫时，对EAE的抑制效果，结果发现CTLA-4或TGFβ的中和抗体削弱了MBP对 CNS自身免疫反应的抑制能力（图2m，n）。
图2 MBP多肽免疫抑制机制MBP多肽的治疗效果
为了评估在神经炎症期间MBP肽的表达是否会发生变化，作者在EAE发病高峰期（第16天）采集了C57BL/6J雄性小鼠的脑、硬脑膜和脊髓样本进行MHC II多肽鉴定（图3a）。结果显示MHC II的表达在EAE小鼠组织中明显增加，且在大脑和硬脑膜中，MBP158-195区域内的肽的呈现明显减少，但在下游的MBP196-236抗原区域未发现明显变化（图3b,c）。然后，将MBP160-175肽封装在胞外囊泡（EVs）中，注射入小鼠的小脑延髓池，以测试其作为潜在抗原特异性免疫疗法的效果。与预期一致，与其他对照组相比，在EAE症状出现之前接种MBP160-175 EVs的小鼠，其自身免疫反应受到明显抑制（图3d）。而且，将MBP160-175 EVs注射入脑脊液也会导致CTLA-4+ Foxp3-CD4+抑制性T细胞的增加，与先前在硬脑膜中观察到的现象一致（图3e-f）。此外，在多个淋巴结（包括dCLNs和sCLNs）中也观察到类似的变化，但不影响脾脏。为了进一步了解这一点，作者将空囊泡或含有MBP160-175的囊泡直接注入CSF后，对硬脑膜和dCLNs进行了scRNA测序，结果接受含有MBP160-175囊泡的小鼠的硬脑膜中Foxp3-Tregs簇出现明显扩增（图3h）。上述结果表明通过向脑脊液提供内源性调节性MBP肽，可以特异性地提高抑制性CD4+ T细胞的数量，从而为中枢神经系统提供足够的保护，以对抗自身免疫反应。
图3 MBP多肽胞外囊泡治疗效果评估小结
本研究全面鉴定了中枢神经系统在免疫稳态期间的MHC II多肽组，这些CNS内源性肽主要分布在大脑边界和引流淋巴结内，可抑制免疫反应。有趣的是，当神经炎症导致内源性肽缺失时，在脑脊液中补充这些肽可显著改善中枢神经系统自身免疫性疾病。这提出了一种可能性，即中枢神经系统寻求适应性免疫系统的参与，以获得“免疫豁免”。此外，在目前的研究中，主要关注MBP肽，但可以预见的是，还会被有其他功能类似的蛋白衍生多肽的存在，进一步了解它们的共同特性将会有助于开发新的抗原特异性治疗方案。
文献原文
https://www.nature.com/articles/s41586-024-08279-y
针对于内源性多肽，PEAKS已经推出更灵敏、更准确的DeepNovo Peptidome分析流程，若您想了解更多，欢迎下方联系方式，提交您的咨询信息！
参考文献
文献原文
https://www.nature.com/articles/s41586-024-08279-y
针对于内源性多肽，PEAKS已经推出更灵敏、更准确的DeepNovo Peptidome分析流程，若您想了解更多，欢迎下方联系方式，提交您的咨询信息！
参考文献
Alspach, E. et al. MHC-II neoantigens shape tumour immunity and response to immunotherapy. Nature 574, 696-701 (2019). https://doi.org:10.1038/s41586-019-1671-8.
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作为生物信息学的领军企业，BSI专注于蛋白质组学和生物药领域，通过机器学习和先进算法提供世界领先的质谱数据分析软件和蛋白质组学服务解决方案，以推进生物学研究和药物发现。我们通过基于AI的计算方案，为您提供对蛋白质组学、基因组学和医学的卓越洞见。旗下著名的PEAKS®️系列软件在全世界拥有数千家学术和工业用户，包括：PEAKS®️ Studio，PEAKS®️ Online，PEAKS®️ GlycanFinder, PEAKS®️ AB，DeepImmu®️ 免疫肽组发现服务和抗体综合表征服务等。Reynisson, B. et al. Improved Prediction of MHC II Antigen Presentation through Integration and Motif Deconvolution of Mass Spectrometry MHC Eluted Ligand Data. J Proteome Res 19, 2304-2315 (2020). https://doi.org:10.1021/acs.jproteome.9b00874.
Shao, X. M. et al. High-Throughput Prediction of MHC Class I and II Neoantigens with MHCnuggets. Cancer Immunol Res 8, 396-408 (2020). https://doi.org:10.1158/2326-6066.CIR-19-0464.
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