针对SARS-CoV-2变异株核衣壳蛋白的单克隆抗体的开发与表征
Omicron变异株及其亚谱系的出现改变了COVID-19大流行进程。尽管毒性有所降低，但其传播性仍然很高。快速抗原检测（RAT）因操作简便、成本低等优势被广泛用于SARS-CoV-2感染的简易诊断，但随着核衣壳蛋白（NP）的不断变异，现有的RAT对Omicron谱系的敏感性逐渐下降，因此开发出能够识别变异毒株NP的抗体对提升RAT检测灵敏性至关重要。 针对这一需求，来自加拿大公共卫生部、国家微生物实验室的Tom Gräfenhan和Ian Wayne Cheney联合发表题为“Development and characterization of monoclonal antibodies recognizing nucleocapsid protein of multiple SARS-CoV-2 variants”的研究成果，他们鉴定出 7 种对 SARS-CoV-2 变异株和重组核衣壳蛋白（rNP）表现出强烈反应性的小鼠单克隆抗体，其中5种抗体对两种奥密克戎亚谱系在内的变异株（VOCs）具有特异性，值得在诊断检测开发中进行进一步的适用性测试。该研究中基于质谱的抗体序列分析使用PEAKS®️ AB完成。
材料和方法
1、SARS-CoV-2特异mAb杂交瘤的生成与筛选
2、抗体对多种SARS-CoV-2变体的反应性测试
11个mAbs均与原始SARS-CoV-2 rNP反应，7个对部分变体有反应，5个对P.1反应强烈，仅2个对B.1.617.2有反应（表2）。
表2 rNP和 SARS-CoV-2 变异株单克隆抗体的Western blot实验
a, marks -, +, ++, +++, and ++++ were based on the band density visualized by experienced technician. -: no band observed. 、b, recombinant nucleocapsid protein of the original strain (Wuhan strain);
c, gamma-irradiated reference strain (hCoV-19/Canada/ON_ON-VIDO-01-2/2020, EPI_ISL_425177);
d, all strains were loaded at 1 × 104 pfu/lane for SDS-PAGE.
3、SARS-CoV-2 NP单抗对SARS-Cov-1、MERS和HCoV的交叉反应性测试
4、mAbs与SARS-CoV-2核衣壳蛋白的结合亲和力测定
5、免疫噬斑及Omicron亚谱系结合力实验
图2 免疫噬斑试验
最后，mAbs对近期流行Omicron亚谱系的结合亲和力验证结果表示，所选5个mAbs对BA.4和BQ.1/BQ.1.1亲和力显著降低，对JN.1亲和力与原始株相近（表4）。
小结
材料和方法
1、SARS-CoV-2特异mAb杂交瘤的生成与筛选
首先用灭活的SARS-CoV-2免疫小鼠以制备杂交瘤，经ELISA、Western Immunoblot等筛选出NP阳性克隆，最终保留了11个亚克隆杂交瘤进行大规模培养和纯化（表1）。然后基于LC-MS/MS技术对纯化的mAbs进行序列测定，抗体经还原、烷基化、PNGaseF酶切糖等处理后，被分为7等份各自经pepsin (pH< 2和pH>2), chymotrypsin, Glu-C, Lys-C, Asp-N 和trypsin酶切后通过nLC-MS/MS检测，质谱数据经PEAKS®️ AB（Bioinformatics Solutions Inc.）分析，自动完成抗体蛋白序列组装及CDR区注释，然后使用IgBLAST(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/index.cgi)基于蛋白质序列进行种系基因比对和等位基因判定。
2、抗体对多种SARS-CoV-2变体的反应性测试
11个mAbs均与原始SARS-CoV-2 rNP反应，7个对部分变体有反应，5个对P.1反应强烈，仅2个对B.1.617.2有反应（表2）。
表2 rNP和 SARS-CoV-2 变异株单克隆抗体的Western blot实验
a, marks -, +, ++, +++, and ++++ were based on the band density visualized by experienced technician. -: no band observed. 、b, recombinant nucleocapsid protein of the original strain (Wuhan strain); c, gamma-irradiated reference strain (hCoV-19/Canada/ON_ON-VIDO-01-2/2020, EPI_ISL_425177);
d, all strains were loaded at 1 × 104 pfu/lane for SDS-PAGE.
3、SARS-CoV-2 NP单抗对SARS-Cov-1、MERS和HCoV的交叉反应性测试
作者通过酶联免疫吸附试验（ELISA）检测了 11 种单克隆抗体（mAbs）与 4 种常见人类冠状病毒（HCoV-HKU1、HCoV-OC43、HCoV-NL63和 HCoV-229E）、严重急性呼吸综合征冠状病毒1型（SARS-CoV-1）以及中东呼吸综合征冠状病毒（MERS）的重组核衣壳蛋白（rNPs）之间潜在的交叉反应性。将未经免疫的兔多克隆抗体和针对无关抗原的小鼠单克隆抗体作为阴性对照，针对选定rNPs的兔多克隆抗体作为阳性对照。结果显示，这些mAbs对MERS和4种常见人类冠状病毒rNPs无反应，部分对SARS-CoV-1 rNP有弱反应（图1）。
图1 SARS-CoV-2抗体对其他冠状病毒NP的反应性
4、mAbs与SARS-CoV-2核衣壳蛋白的结合亲和力测定
参与测试的7种单克隆抗体都与原始毒株以及5种关切变异株（VOCs）的rNPs表现出强结合力。F461G6和F461G13对所有变异株的rNPs都有很强的结合力，其他抗体则结合力各有差异（表3）。
表3 终点ELISA法检测SARS-CoV-2变体rNPs
5、免疫噬斑及Omicron亚谱系结合力实验
在免疫噬斑试验中，7种mABs对SARS-CoV-2变异株表现出不同的反应性（图2）。F457G3、F459G7、F461G6、F461G7和F461G13对所有测试的变异株都表现出强烈反应，包括参考毒株、关切变异株B.1.1.7、B.1.351、P.1、B.1.617.2，以及奥密克戎B.1.1.529和BA.2。F457G2对参考毒株和P.1表现出强烈反应，但对大多数变异株反应较弱，对B.1.617.2（德尔塔变异株）无反应。相比之下，F457G6对参考毒株和P.1反应较弱，对其他变异株无反应。
图2 免疫噬斑试验最后，mAbs对近期流行Omicron亚谱系的结合亲和力验证结果表示，所选5个mAbs对BA.4和BQ.1/BQ.1.1亲和力显著降低，对JN.1亲和力与原始株相近（表4）。
小结
Omicron高传播性仍具有较大的威胁，RAT早期诊断和抗病毒治疗意义重大。本研究筛选出5个对多种VOCs反应强烈、对常见冠状病毒等反应微弱的mAbs，但不同检测方法结果存在差异，与抗原处理、缓冲液等因素有关。NP是理想诊断抗原，M蛋白也有潜力。这5个mAbs还需针对最新Omicron亚谱系进一步测试。
作为生物信息学的领军企业，BSI专注于蛋白质组学和生物药领域，通过机器学习和先进算法提供世界领先的质谱数据分析软件和蛋白质组学服务解决方案，以推进生物学研究和药物发现。我们通过基于AI的计算方案，为您提供对蛋白质组学、基因组学和医学的卓越洞见。旗下著名的PEAKS®️系列软件在全世界拥有数千家学术和工业用户，包括：PEAKS®️ Studio，PEAKS®️ Online，PEAKS®️ GlycanFinder, PEAKS®️ AB，DeepImmu®️ 免疫肽组发现服务和抗体综合表征服务等。
联系方式：021-60919891；sales-china@bioinfor.com
