泰乐菌素检测试剂盒使用说明书（酶联免疫法）

 
1、 原理及用途
本试剂盒采用间接竞争ELISA方法，检测禽类组织、蜂蜜等样本中的泰乐菌素含量。试剂盒由预包被偶联抗原的酶标板、辣根酶标记物、抗体、标准品及其他配套试剂组成。检测时，加入标准品或样品溶液，样本中的泰乐菌素和酶标板上预包被偶联抗原竞争抗泰乐菌素抗体，再与酶标记物形成抗原抗体复合物，用TMB底物显色，样本吸光度值与其泰乐菌素含量成负相关，与标准曲线比较乘以样本稀释倍数即可得出样本中泰乐菌素的残留量。

2、 技术指标
2.1 试剂盒灵敏度：0.5ppb(ng/ml)
2.2 反应模式：25℃，30min～30min～15min
2.3 检测下限：
禽组织…………………………1ppb
蜂蜜…………………………0.5ppb
禽蛋、牛奶…………………25ppb
2.4 交叉反应率：
泰乐菌素 ………………………100%
红霉素………………………… 1%
与其他大环内酯类药物交叉反应小于1%
 2.5 样本回收率：
组织…………………………………85±10%
蜂蜜、禽蛋、牛奶…………………85±15%

3、 试剂盒组成
酶标板……………………………96孔
标准液：各1ml
0ppb、0.5ppb、1.5 ppb、4.5ppb、13.5ppb、40.5ppb
酶标记物（红盖）…………………11ml
抗体工作液（蓝盖）…………………5.5ml
底物液A（白盖）……………………6ml
底物液B（黑盖）……………………6ml
终止液（黄盖）………………………6ml
2×复溶液（黄盖）…………………50ml
20×浓缩洗涤液（白盖）……………40ml
说明书…………………………………1份
盖板膜…………………………………1张
自封袋…………………………………1个

4、 需要的器材和试剂
4.1 仪器：酶标仪、打印机、均质器 、振荡器、氮气吹干装置、离心机、刻度移液管、天平（感量0.01g）
4.2 微量移液器：单道20µl-200µl，100µl-1000µl、多道300µl
4.3 试剂：NaOH、甲醇、浓HCl、乙腈、三氯甲烷、正己烷

5、 样本前处理
5.1 样本处理前须知：
实验器具必须洁净并使用一次性吸头，以避免污染干扰实验结果。
5.2 配液：
样本前处理需配制：
配液1：0.1M  NaOH
0.4g NaOH 加去离子水混匀溶解，定容至100ml。
配液2：0.01M  NaOH
0.4g NaOH 加去离子水混匀溶解，定容至1L。
配液3：0.1M  HCL
    8.6mL浓HCL加去离子水混匀，定容至1L。
配液4：样本提取液（乙腈-0.1M HCl）—甲醇溶液
取乙腈84ml先加入0.1M HCl 16ml混匀后，再加入18ml甲醇混匀。
配液5：复溶液
2×复溶液用去离子水2倍稀释（1份2×复溶液加1份去离子水）
配液6：工作洗涤液
    将浓缩洗涤液20倍稀释(1份洗涤液加19份去离子水)。
5.3.1 禽组织处理方法 
1） 称取均质样本2±0.05g于50ml离心管中，加入8ml样本提取液，用振荡器振荡5分钟；4000转/分以上,室温离心10分钟；
2） 取上清液2ml，加入0.1M NaOH溶液1ml,混合后加入 3ml三氯甲烷萃取，振荡器上振荡5分钟；4000转/分以上，室温离心10分钟。
3）去除上层相，取下层全部有机相至干净玻璃试管中，于56℃水浴下氮气/空气吹干；
4） 用1ml稀释后的复溶液溶解干燥后的残留物，混合30s；
5） 取50ul用于分析。
样本稀释倍数：2        检测下限：1ppb
5.3.2 蜂蜜处理方法
1）称取1±0.05g样本于50ml离心管中，加2ml去离子水涡动2分钟使其溶解；
2）再加入10ml三氯甲烷上下振荡5分钟，4000转/分，室温离心10分钟。
3） 去除上层相，取下层全部有机相至干净玻璃试管中，于56℃水浴下氮气或空气吹干；
4） 用1ml稀释后的复溶液溶解干燥后的残留物，混合30s；
5） 取50ul用于分析。
样本稀释倍数：1      检测下限：0.5ppb
5.3.3 禽蛋处理方法
1） 将禽蛋打破去皮匀浆后取1g±0.05g于15ml离心管中，加入0.01M NaOH 4ml，振荡2分钟，室温4000r/分离心10分钟；
2） 取上层液体2ml于15ml离心管中，加入4ml正己烷，振荡2分钟，室温4000r/分离心10分钟；
3） 去除上层正己烷，小心穿过中间层浅黄色果冻状物质取下层清液0.1ml于1.5ml离心管中，再加入0.9ml稀释后的复溶液，振荡混匀30s,取50ul分析。
样本稀释倍数：50      检测下限：25ppb
5.3.4 牛奶处理方法
1）取0.5ml牛奶于15ml离心管中，加入0.01M NaOH 2ml，振荡2分钟，室温4000r/分离心10分钟；
2）取上层液体1ml于15ml离心管中，加入2ml正己烷，振荡2分钟，室温4000r/分离心10分钟；
3）去除上层正己烷，小心穿过中间层果冻状物质取下层清液0.1ml于1.5ml离心管中，再加入0.9ml稀释后的复溶液，振荡混匀30s,取50ul分析。
样本稀释倍数：50      检测下限：25ppb 

6、 酶联免疫试验步骤
将所需试剂从4℃冷藏环境中取出，置于室温平衡30min以上, 洗涤液冷藏时可能会有结晶需恢复到室温以充分溶解，每种液体试剂使用前均须摇匀。取出需要数量的微孔板及框架，将不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。
6.1 编    号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。
6.2 加样反应：加标准品或样本50µl/孔到各自的微孔中，然后加抗体工作液50µl/孔，轻轻振荡5秒混匀，25℃避光反应30分钟。
6.3 洗    涤：小心揭开盖板膜，甩去孔内液体，每孔加350ul工作洗涤液，静置30秒后弃去，重复洗涤5次，最后一次拍干。（用吸水纸拍干，拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破）。
6.4 加酶反应：加酶标记物100µl/孔，25℃避光反应30分钟。
6.5 洗    涤：同上
6.6 显    色：加底物液A 50µl/孔，再加底物液B 50µl/孔，轻轻振荡5秒混匀，25℃避光显色15分钟（若蓝色过浅，可适当延长反应时间）。
6.7 终    止：加终止液50µl/孔，轻轻振荡混匀，终止反应。
6.8 测吸光值：用酶标仪于450nm处测定每孔吸光度值（建议用双波长450/630nm）。测定应在终止反应后10分钟内完成。

7、 结果分析
7.1 百分吸光率的计算
    标准液或样本的百分吸光率等于标准液或样本的百分吸光度值的平均值（双孔）除以第一个标准液（0ppb）的吸光度值，再乘以100%，即

百分吸光度值（%）＝	A	×100%
	A0

A—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值
A0—0ppb标准溶液的平均吸光度值
7.2 标准曲线的绘制与计算
以标准液百分吸光率为纵坐标，对应的标准液浓度（ppb）的对数为横坐标，绘制标准液的半对数曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中待测物的实际浓度。
若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样本的准确、快速分析。（欢迎来电索取）

8、 注意事项
8.1 室温低于25℃或试剂及样本没有回到室温（25℃）会导致所有标准的OD值偏低。
8.2 在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。
8.3 混合要均匀，洗板要彻底，在ELISA分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性。
8.4 在所有孵育过程中，用盖板膜封住微孔板，避免光线照射。
8.5 不要使用过了有效期的试剂盒，不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂。
8.6 显色液若有任何颜色表明变质，应当弃之。0标准的吸光度值小于0.5个单位（A450nm< 0.5 ）时，表示试剂可能变质。
8.7 反应终止液有腐蚀性，避免接触皮肤。           

9、 贮藏及保存期
储藏条件：试剂盒于2-8℃保存，避免冷冻。
保 质 期：该产品有效期为1年，生产日期见包装盒。