利用染色质免疫共沉淀测序技术ChIP-seq等揭示头颈鳞癌免疫逃逸机制
免疫逃逸是癌症进展的关键里程碑，是肿瘤免疫治疗的理论基础。头颈部鳞状细胞癌（(head and neck squamous cell carcinoma, HNSCC)）是全球最常见的恶性肿瘤之一，传统治疗选择包括手术切除、放疗和化疗。最近，利用免疫检查点抑制剂如PD-1/PD-L1单克隆抗体的免疫疗法，已成为治疗难治性复发/转移HNSCC的有希望方法。但超过80%患者仍然表现出固有的药物抗性，不能单独从PD-1/PD-L1免疫疗法中受益。其他免疫检查点分子在HNSCC免疫逃逸中的潜力，影响抗PD-1/PD-L1免疫疗法的效果。因此，进一步探索HNSCC免疫逃逸机制具有至关重要的意义。
人类乳头瘤病毒(Human papillomavirus，HPV）感染与多种HNSCC发生发展相关，HPV16、18、31、33和35等高风险类型，易于诱发各种人类恶性肿瘤，其中HPV16是最普遍的高风险亚型。最近发现HPV可以编码环状RNA（circRNA），而circE7是唯一被鉴定出由高风险HPV16特异性编码的环状RNA。circE7通过影响宿主细胞的表观遗传调控，可能参与肿瘤免疫逃逸和免疫治疗抗性形成。但circE7的生物学功能仍然大部分未知，它在肿瘤免疫逃逸和免疫疗法抗性中的参与尚未被报道。
2024年10月4日，中南大学博士后葛军尚、博士生孟依、硕士生郭佳玥为并列第一作者，中南大学基础医学院曾朝阳、熊炜和中南大学湘雅二医院口腔医学中心龚朝建为共同通讯作者，利用染色质免疫共沉淀测序技术（ChIP-seq）等实验揭示了HPV编码的环状RNA circE7促进头颈部鳞状细胞癌的免疫逃逸机制。相关研究成果以“Human papillomavirus-encoded circular RNA circE7 promotes immune evasion in head and neck squamous cell carcinoma”为题发表在Nature子刊《nature communications》上。
标题：Human papillomavirus-encoded circular RNA circE7 promotes immune evasion in head and neck squamous cell carcinoma（HPV编码的环状RNA circE7促进头颈部鳞状细胞癌的免疫逃逸）
期刊：Nature Communications
影响因子： IF 14.7 / 1区
技术平台：RT-qPCR、RNA pulldown、western blot、ChIP-seq、RIP实验、动物实验等
本研究通过整合23对HNSCC肿瘤样本及其邻近正常组织，以及105个HNSCC患者的石蜡包埋样本，结合细胞和动物实验，首先观察到circE7表达与HPV HNSCC临床组织中浸润的T细胞呈负相关。体外和体内实验进一步证实，circE7通过表观遗传机制下调LGALS9基因（编码Galectin-9蛋白），从而抑制T细胞功能和活性，进而促进HNSCC免疫逃逸。而LGALS9基因编码的galectin-9蛋白能够与T细胞表面的TIM-3和PD-1等免疫检查点分子结合，进而激活T细胞释放细胞毒性细胞因子并抑制T细胞凋亡。circE7下调Galectin-9，导致CD8+T功能和活性受到抑制；而circE7下调LGALS9表达的具体分子机制是circE7结合并抑制乙酰辅酶A羧化酶1 (acetyl-CoA carboxylase 1, ACC1)的磷酸化和激活，降低细胞内乙酰辅酶A水平，导致LGALS9启动子区域H3K27乙酰化水平降低，通过表观遗传调控抑制LGALS9的表达；最后通过体内外模型证实联合使用TIM-3 (Galectin-9在T细胞上的受体)与PD-1单克隆抗体能显著提高HNSCC的免疫治疗效果。②
总之，本研究展示了HPV通过circE7驱动的表观遗传修饰促进HNSCC免疫逃逸机制，并提出了联合使用抗PD-1和抗TIM-3抑制剂的HNSCC潜在免疫治疗策略，这种联合治疗选择可以增强HNSCC免疫疗法的效果，为头颈鳞癌免疫治疗提供了新靶点和潜在治疗策略。
结果图形
（1）circE7在HPV+（阳性）的HNSCC中表达，并与T细胞浸润和galectin-9表达呈负相关。
图1：circE7在HPV+ HNSCC中高表达，且与CD8+ T细胞功能和免疫检查点galectin-9表达呈负相关。A. 通过设计跨剪接位点引物并使用Sanger测序，鉴定circE7为通过HPV16 E6尾部、E7和部分E1序列的反向剪接形成的472nt环状RNA。
B. 使用23个HNSCC组织进行RT-qPCR检测CD8A、IFNG、GZMB和TNFA的表达，并分析了它们与circE7表达的相关性。与circE7阴性样本相比，circE7阳性HNSCC样本中CD8A、IFNG、GZMB和TNFA的表达显著降低。（circE7阴性，n=16；circE7阳性，n=7）。
C. 在105个HNSCC组织中，通过原位杂交检测circE7表达。通过免疫组化检测浸润CD8+ T细胞中p16、HPV16 E7蛋白和CD8A的表达。在这105个HNSCC病例中，有17个是HPV阳性，所有这些病例都是HPV16阳性且circE7表达。circE7表达水平与CD8+ T细胞浸润呈负相关。（HPV阴性，n=88；HPV阳性，n=17）。
D-F. 在HPV阴性HNSCC细胞系CAL27和HN30中过表达circE7，或在HPV16阳性HNSCC细胞系SCC090和SCC154中转染靶向circE7的siRNA。RT-qPCR（D）检测LGALS9 mRNA，western blotting（E）和流式细胞术（F）检测galectin-9蛋白表达。
G. 在（B）中使用的23个新鲜HNSCC组织样本上进行RT-qPCR检测LGALS9 mRNA。与circE7阴性组织相比，circE7阳性HNSCC组织中LGALS9 mRNA水平显著降低。（circE7阴性，n=16；circE7阳性，n=7）。
H. 通过免疫组化在（C）中使用的105个HNSCC组织上检测galectin-9表达，并分析其与circE7表达的相关性。（circE7阴性，n=88；circE7阳性，n=17）。
（2）circE7通过下调LGALS9表达促进HNSCC免疫逃逸
图2：circE7下调HNSCC细胞中galectin-9表达，以体外抑制CD8+ T细胞功能。
在CAL27、HN30、SCC090和SCC154细胞中，过表达或敲低LGALS9，随后与人原代T细胞以1:10的比例共培养6小时。
A. 通过RT-qPCR检测原代T细胞中IFNG、GZMB和TNFA的表达水平。在CAL27和HN30细胞系中，同时过表达circE7和LGALS9。在SCC090和SCC154细胞系中，同时敲低circE7和LGALS9。然后将这些细胞与人原代T细胞共培养6小时。
B. T-qPCR用于检测IFNG、GZMB和TNFA mRNA表达。
C. 通过ELISA检测共培养基中IFN-γ、GZMB和TNF-α的水平。
D-E. 流式细胞术以鉴定总CD8+ T细胞中IFN-γ+ GZMB+和IFN-γ+ TNF-α+ T细胞的比例。
F. 通过Annexin V/PI染色后进行流式细胞术以评估凋亡CD8+ T细胞比例。
G. 使用Annexin V/PI染色后进行流式细胞术以凋亡肿瘤细胞比例。
（3）Galectin-9通过与TIM-3和PD-1结合增强CD8+ T细胞的抗肿瘤活性
图3：Galectin-9通过与TIM-3和PD-1结合增强T细胞的功能和活性。在CAL27、HN30、SCC090和SCC154细胞中，进行Galectin-9过表达或敲低，然后加入10mg/mL乳糖，并与人原代T细胞以1:10比例共培养6小时。
A. 流式细胞术检测总CD8+ T细胞群中IFN-γ+ GZMB+和IFN-γ+ TNF-α+细胞的百分比。
B. 使用Annexin V/PI检测评估CD8+ T细胞的凋亡水平。在CAL27、HN30、SCC090和SCC154细胞中，进行Galectin-9过表达或敲低，然后加入5μg/mL抗PD-1和抗TIM-3，并与人原代T细胞以1:10的比例共培养6小时。
C. 流式细胞术检测总CD8+ T细胞群中IFN-γ+ GZMB+和IFN-γ+ TNF-α+细胞的百分比。
D. 使用Annexin V/PI检测评估CD8+ T细胞的凋亡水平。此外，人原代T细胞与1μg/mL重组Galectin-9蛋白共培养，同时加入抗TIM-3、抗PD-1和乳糖。
E. 使用Annexin V/PI检测评估CD8+ T细胞的凋亡水平。
F. 流式细胞术检测总CD8+ T细胞群中IFN-γ+ GZMB+和IFN-γ+ TNF-α+细胞的百分比。人原代CD8+ T细胞与1μg/mL重组Galectin-9、HMGB1蛋白和抗TIM-3共培养。
G. 流式细胞术检测总CD8+ T细胞群中IFN-γ+ GZMB+和IFN-γ+ TNF-α+细胞的百分比。BSA为阴性对照。
H. 流式细胞术检测附着在CD8+ T细胞表面的Galectin-9和HMGB1蛋白水平。
（4）circE7结合并激活ACC1以抑制乙酰辅酶A（acetyl-CoA）并抑制Galectin-9表达
图4：circE7表观遗传下调ACC1介导的Galectin-9表达。
A. 使用生物素标记的circE7探针进行RNA pulldown分析，以检测CAL27和HN30细胞中circE7与ACC1蛋白之间的结合。非生物素标记的circE7探针用作对照。
B. 在circE7过表达的CAL27和HN30细胞、或HPV阳性SCC090和SCC154细胞中，使用抗ACC1抗体进行RIP检测ACC1蛋白与circE7的结合，然后RT-qPCR定量分析。
C. 使用抗Flag抗体进行RNA免疫沉淀，以评估ACC1蛋白与其截断突变体与circE7的结合，然后对circE7进行RT-qPCR分析。
D. 使用生物素标记的circE7探针进行RNA pulldown，并使用抗Flag抗体进行western blot，以检测circE7与ACC1及其截断突变体之间的结合。
E. 使用抗ACC1抗体进行RNA免疫沉淀，以评估ACC1蛋白与circE7及其截断突变体之间的直接结合，然后对circE7及其截断突变体进行RT-qPCR分析。
F. 使用生物素标记的circE7探针进行RNA pulldown，以研究circE7及其截断突变体与ACC1蛋白之间的结合。在CAL27和HN30细胞中过表达circE7，或在SCC090和SCC154细胞中转染si-circE7。
G. western blot检测总ACC1蛋白和p-ACC1蛋白的表达水平。
H. 使用乙酰辅酶A检测试剂盒检测细胞裂解物中的乙酰辅酶A含量。
I. western blot检测整体乙酰化的表达水平。
J. western blot 检测H3K27 Ac、H3K9 Ac、H3K14 Ac和H3K23 Ac的表达水平。
K. 在HN30细胞中过表达circE7，ChIP-seq peaks显示LGALS9启动子区域的H3K27ac水平。横轴代表基因组坐标，纵轴代表ChIP-seq信号强度。
L. ChIP-qPCR用于研究在CAL27和HN30细胞中过表达circE7或在SCC090和SCC154细胞中敲低circE7后LGALS9启动子区域H3K27乙酰化水平变化。
图4-1：HN30细胞中过表达circE7的ChIP-seq和ChIP-qPCR分析。
M. 在HN30细胞中过表达circE7，CHIP-seq peaks显示H3K27ac的整体水平。
N. hockey stick plot显示在HN30细胞中，与Vector和OE-circE7相比，突出显示SE相关基因的input归一化、等级排序的H3K27ac信号。
O. 在GSE1855312和ENCODE数据库中分析LGALS9启动子区域的H3K27Ac水平。
图5：ACC1是circE7在LGALS9转录表观遗传调控中的关键下游调控靶点。
A. 三个ACC1 siRNA被转染到CAL27和HN30细胞中，或在SCC090和SCC154细胞中过表达ACC1，使用RT-qPCR检测LGALS9 mRNA表达水平。
B. 使用Western blot检测ACC1和galectin-9蛋白的表达水平。在CAL27和HN30细胞中过表达circE7的同时敲低ACC1，或者在SCC090和SCC154细胞中敲低circE7的同时过表达ACC1。
C. 使用RT-qPCR检测LGALS9 mRNA的表达水平。
D. 使用Western blot检测ACC1、H3K27 Ac和galectin-9蛋白的水平。在CAL27和HN30细胞中过表达circE7的同时加入ACC1的小分子抑制剂TOFA。
E. 使用RT-qPCR检测LGALS9 mRNA的表达水平。
F. 使用Western blot检测H3K27Ac和galectin-9蛋白水平。
（5）TIM-3和PD-1单克隆抗体的联合应用大大提高了HNSCC免疫治疗效果
图6：外源性TIM-3和PD-1单克隆抗体的联合治疗增强了CD8+ T细胞的细胞毒性功能。
CAL27和HN30细胞进行circE7过表达，或SCC090和SCC154细胞circE7敲低，然后与人原代T细胞共培养6小时，加入5μg/mL抗PD-1或抗PD-1/TIM-3。
A. 使用RT-qPCR检测CD8+ T细胞中IFNG、GZMB和TNFA mRNA的表达水平。
B. 使用流式细胞术检测所有CD8+ T细胞中IFN-γ+ GZMB+和IFN-γ+ TNF-α+ T细胞的比例。
C-D. 使用Annexin V/PI染色评估CD8+ T细胞（C）和肿瘤细胞（D）的凋亡水平。
图7：TIM-3和PD-1单克隆抗体的联合治疗显著提高了HNSCC免疫治疗效果。
裸鼠通过右后肢注射1×10^6过表达circE7的HN30细胞或载体对照，或注射敲低circE7或NC对照的SCC090细胞来形成异种移植肿瘤。7天和14天后，注射人原代T细胞和20μg/每个的抗PD-1或抗PD-1/TIM-3进行免疫治疗。
A-B. T细胞被标记为DeepRed，进行体内成像以检测携带肿瘤小鼠中人原代T细胞的生存和分布（每组n=3）。A 代表性图像；B 注射后1、3、5和7天收集的肿瘤部位（右大腿底部）的DiR荧光信号与T细胞荧光强度比率的统计结果。颜色标尺代表小鼠T细胞的DiR荧光强度。
C. 代表性肿瘤图像。左图，HN30细胞注射后24天（每组n=6）；右图，SCC090细胞注射后56天（每组n=6）。
D. 每周实时测量注射HN30或SCC090细胞的小鼠的肿瘤体积（每组n=6）。
E. 通过免疫组化检测石蜡包埋的HN30和SCC090异种移植肿瘤中Galectin-9表达，并对结果进行统计分析（每组n=6）。
F. 通过免疫组化检测HN30和SCC090异种移植肿瘤中CD8A的表达，并对结果进行统计分析（每组n=6）。
图8：小鼠原位移植模型显示PD-1和TIM-3单克隆抗体的联合使用增强了HNSCC免疫治疗的疗效。C3H小鼠在右侧脸颊注射2×10^5过表达circE7的SCC-7细胞或载体对照，形成异种移植肿瘤。3天后，注射20μg/次的抗PD-1或抗PD-1/TIM-3进行免疫治疗。
A. 代表性肿瘤图像（每组n=7）。
B. 肿瘤体积在SCC-7细胞注射后3天、7天和10天的测量结果（每组n=7）。
C. 注射SCC-7细胞后10天测量的肿瘤重量（每组n=7）。
D. 从小鼠肿瘤组织中制备单细胞悬浮液，通过RT-qPCR检测IFNG、GZMB和TNFA mRNA表达（每组n=3）。
E. 使用ELISA检测IFN-γ、GZMB和TNF-α的含量（每组n=3）。
F-G. 流式细胞术检测CD8+ T细胞的比例（F）以及总CD8+ T细胞群中IFN-γ+ TNF-α+细胞的百分比（G）（每组n=3）。
H. 通过免疫组化检测SCC-7异种移植肿瘤中Cd8A表达，并对结果进行统计分析（每组n=5）。
I. 通过免疫组化检测石蜡包埋的SCC-7异种移植肿瘤中galectin-9表达，并对结果进行统计分析（每组n=5）。
参考文献：
人类乳头瘤病毒(Human papillomavirus，HPV）感染与多种HNSCC发生发展相关，HPV16、18、31、33和35等高风险类型，易于诱发各种人类恶性肿瘤，其中HPV16是最普遍的高风险亚型。最近发现HPV可以编码环状RNA（circRNA），而circE7是唯一被鉴定出由高风险HPV16特异性编码的环状RNA。circE7通过影响宿主细胞的表观遗传调控，可能参与肿瘤免疫逃逸和免疫治疗抗性形成。但circE7的生物学功能仍然大部分未知，它在肿瘤免疫逃逸和免疫疗法抗性中的参与尚未被报道。
2024年10月4日，中南大学博士后葛军尚、博士生孟依、硕士生郭佳玥为并列第一作者，中南大学基础医学院曾朝阳、熊炜和中南大学湘雅二医院口腔医学中心龚朝建为共同通讯作者，利用染色质免疫共沉淀测序技术（ChIP-seq）等实验揭示了HPV编码的环状RNA circE7促进头颈部鳞状细胞癌的免疫逃逸机制。相关研究成果以“Human papillomavirus-encoded circular RNA circE7 promotes immune evasion in head and neck squamous cell carcinoma”为题发表在Nature子刊《nature communications》上。
期刊：Nature Communications
影响因子： IF 14.7 / 1区
技术平台：RT-qPCR、RNA pulldown、western blot、ChIP-seq、RIP实验、动物实验等
本研究通过整合23对HNSCC肿瘤样本及其邻近正常组织，以及105个HNSCC患者的石蜡包埋样本，结合细胞和动物实验，首先观察到circE7表达与HPV HNSCC临床组织中浸润的T细胞呈负相关。体外和体内实验进一步证实，circE7通过表观遗传机制下调LGALS9基因（编码Galectin-9蛋白），从而抑制T细胞功能和活性，进而促进HNSCC免疫逃逸。而LGALS9基因编码的galectin-9蛋白能够与T细胞表面的TIM-3和PD-1等免疫检查点分子结合，进而激活T细胞释放细胞毒性细胞因子并抑制T细胞凋亡。circE7下调Galectin-9，导致CD8+T功能和活性受到抑制；而circE7下调LGALS9表达的具体分子机制是circE7结合并抑制乙酰辅酶A羧化酶1 (acetyl-CoA carboxylase 1, ACC1)的磷酸化和激活，降低细胞内乙酰辅酶A水平，导致LGALS9启动子区域H3K27乙酰化水平降低，通过表观遗传调控抑制LGALS9的表达；最后通过体内外模型证实联合使用TIM-3 (Galectin-9在T细胞上的受体)与PD-1单克隆抗体能显著提高HNSCC的免疫治疗效果。②
总之，本研究展示了HPV通过circE7驱动的表观遗传修饰促进HNSCC免疫逃逸机制，并提出了联合使用抗PD-1和抗TIM-3抑制剂的HNSCC潜在免疫治疗策略，这种联合治疗选择可以增强HNSCC免疫疗法的效果，为头颈鳞癌免疫治疗提供了新靶点和潜在治疗策略。
结果图形
（1）circE7在HPV+（阳性）的HNSCC中表达，并与T细胞浸润和galectin-9表达呈负相关。
B. 使用23个HNSCC组织进行RT-qPCR检测CD8A、IFNG、GZMB和TNFA的表达，并分析了它们与circE7表达的相关性。与circE7阴性样本相比，circE7阳性HNSCC样本中CD8A、IFNG、GZMB和TNFA的表达显著降低。（circE7阴性，n=16；circE7阳性，n=7）。
C. 在105个HNSCC组织中，通过原位杂交检测circE7表达。通过免疫组化检测浸润CD8+ T细胞中p16、HPV16 E7蛋白和CD8A的表达。在这105个HNSCC病例中，有17个是HPV阳性，所有这些病例都是HPV16阳性且circE7表达。circE7表达水平与CD8+ T细胞浸润呈负相关。（HPV阴性，n=88；HPV阳性，n=17）。
D-F. 在HPV阴性HNSCC细胞系CAL27和HN30中过表达circE7，或在HPV16阳性HNSCC细胞系SCC090和SCC154中转染靶向circE7的siRNA。RT-qPCR（D）检测LGALS9 mRNA，western blotting（E）和流式细胞术（F）检测galectin-9蛋白表达。
G. 在（B）中使用的23个新鲜HNSCC组织样本上进行RT-qPCR检测LGALS9 mRNA。与circE7阴性组织相比，circE7阳性HNSCC组织中LGALS9 mRNA水平显著降低。（circE7阴性，n=16；circE7阳性，n=7）。
H. 通过免疫组化在（C）中使用的105个HNSCC组织上检测galectin-9表达，并分析其与circE7表达的相关性。（circE7阴性，n=88；circE7阳性，n=17）。
（2）circE7通过下调LGALS9表达促进HNSCC免疫逃逸
图2：circE7下调HNSCC细胞中galectin-9表达，以体外抑制CD8+ T细胞功能。
A. 通过RT-qPCR检测原代T细胞中IFNG、GZMB和TNFA的表达水平。在CAL27和HN30细胞系中，同时过表达circE7和LGALS9。在SCC090和SCC154细胞系中，同时敲低circE7和LGALS9。然后将这些细胞与人原代T细胞共培养6小时。
B. T-qPCR用于检测IFNG、GZMB和TNFA mRNA表达。
C. 通过ELISA检测共培养基中IFN-γ、GZMB和TNF-α的水平。
D-E. 流式细胞术以鉴定总CD8+ T细胞中IFN-γ+ GZMB+和IFN-γ+ TNF-α+ T细胞的比例。
F. 通过Annexin V/PI染色后进行流式细胞术以评估凋亡CD8+ T细胞比例。
G. 使用Annexin V/PI染色后进行流式细胞术以凋亡肿瘤细胞比例。
（3）Galectin-9通过与TIM-3和PD-1结合增强CD8+ T细胞的抗肿瘤活性
图3：Galectin-9通过与TIM-3和PD-1结合增强T细胞的功能和活性。在CAL27、HN30、SCC090和SCC154细胞中，进行Galectin-9过表达或敲低，然后加入10mg/mL乳糖，并与人原代T细胞以1:10比例共培养6小时。
B. 使用Annexin V/PI检测评估CD8+ T细胞的凋亡水平。在CAL27、HN30、SCC090和SCC154细胞中，进行Galectin-9过表达或敲低，然后加入5μg/mL抗PD-1和抗TIM-3，并与人原代T细胞以1:10的比例共培养6小时。
C. 流式细胞术检测总CD8+ T细胞群中IFN-γ+ GZMB+和IFN-γ+ TNF-α+细胞的百分比。
D. 使用Annexin V/PI检测评估CD8+ T细胞的凋亡水平。此外，人原代T细胞与1μg/mL重组Galectin-9蛋白共培养，同时加入抗TIM-3、抗PD-1和乳糖。
E. 使用Annexin V/PI检测评估CD8+ T细胞的凋亡水平。
F. 流式细胞术检测总CD8+ T细胞群中IFN-γ+ GZMB+和IFN-γ+ TNF-α+细胞的百分比。人原代CD8+ T细胞与1μg/mL重组Galectin-9、HMGB1蛋白和抗TIM-3共培养。
G. 流式细胞术检测总CD8+ T细胞群中IFN-γ+ GZMB+和IFN-γ+ TNF-α+细胞的百分比。BSA为阴性对照。
H. 流式细胞术检测附着在CD8+ T细胞表面的Galectin-9和HMGB1蛋白水平。
（4）circE7结合并激活ACC1以抑制乙酰辅酶A（acetyl-CoA）并抑制Galectin-9表达
图4：circE7表观遗传下调ACC1介导的Galectin-9表达。
B. 在circE7过表达的CAL27和HN30细胞、或HPV阳性SCC090和SCC154细胞中，使用抗ACC1抗体进行RIP检测ACC1蛋白与circE7的结合，然后RT-qPCR定量分析。
C. 使用抗Flag抗体进行RNA免疫沉淀，以评估ACC1蛋白与其截断突变体与circE7的结合，然后对circE7进行RT-qPCR分析。
D. 使用生物素标记的circE7探针进行RNA pulldown，并使用抗Flag抗体进行western blot，以检测circE7与ACC1及其截断突变体之间的结合。
E. 使用抗ACC1抗体进行RNA免疫沉淀，以评估ACC1蛋白与circE7及其截断突变体之间的直接结合，然后对circE7及其截断突变体进行RT-qPCR分析。
F. 使用生物素标记的circE7探针进行RNA pulldown，以研究circE7及其截断突变体与ACC1蛋白之间的结合。在CAL27和HN30细胞中过表达circE7，或在SCC090和SCC154细胞中转染si-circE7。
G. western blot检测总ACC1蛋白和p-ACC1蛋白的表达水平。
H. 使用乙酰辅酶A检测试剂盒检测细胞裂解物中的乙酰辅酶A含量。
I. western blot检测整体乙酰化的表达水平。
J. western blot 检测H3K27 Ac、H3K9 Ac、H3K14 Ac和H3K23 Ac的表达水平。
K. 在HN30细胞中过表达circE7，ChIP-seq peaks显示LGALS9启动子区域的H3K27ac水平。横轴代表基因组坐标，纵轴代表ChIP-seq信号强度。
L. ChIP-qPCR用于研究在CAL27和HN30细胞中过表达circE7或在SCC090和SCC154细胞中敲低circE7后LGALS9启动子区域H3K27乙酰化水平变化。
图4-1：HN30细胞中过表达circE7的ChIP-seq和ChIP-qPCR分析。
N. hockey stick plot显示在HN30细胞中，与Vector和OE-circE7相比，突出显示SE相关基因的input归一化、等级排序的H3K27ac信号。
O. 在GSE1855312和ENCODE数据库中分析LGALS9启动子区域的H3K27Ac水平。
图5：ACC1是circE7在LGALS9转录表观遗传调控中的关键下游调控靶点。
B. 使用Western blot检测ACC1和galectin-9蛋白的表达水平。在CAL27和HN30细胞中过表达circE7的同时敲低ACC1，或者在SCC090和SCC154细胞中敲低circE7的同时过表达ACC1。
C. 使用RT-qPCR检测LGALS9 mRNA的表达水平。
D. 使用Western blot检测ACC1、H3K27 Ac和galectin-9蛋白的水平。在CAL27和HN30细胞中过表达circE7的同时加入ACC1的小分子抑制剂TOFA。
E. 使用RT-qPCR检测LGALS9 mRNA的表达水平。
F. 使用Western blot检测H3K27Ac和galectin-9蛋白水平。
（5）TIM-3和PD-1单克隆抗体的联合应用大大提高了HNSCC免疫治疗效果
图6：外源性TIM-3和PD-1单克隆抗体的联合治疗增强了CD8+ T细胞的细胞毒性功能。
A. 使用RT-qPCR检测CD8+ T细胞中IFNG、GZMB和TNFA mRNA的表达水平。
B. 使用流式细胞术检测所有CD8+ T细胞中IFN-γ+ GZMB+和IFN-γ+ TNF-α+ T细胞的比例。
C-D. 使用Annexin V/PI染色评估CD8+ T细胞（C）和肿瘤细胞（D）的凋亡水平。
图7：TIM-3和PD-1单克隆抗体的联合治疗显著提高了HNSCC免疫治疗效果。
A-B. T细胞被标记为DeepRed，进行体内成像以检测携带肿瘤小鼠中人原代T细胞的生存和分布（每组n=3）。A 代表性图像；B 注射后1、3、5和7天收集的肿瘤部位（右大腿底部）的DiR荧光信号与T细胞荧光强度比率的统计结果。颜色标尺代表小鼠T细胞的DiR荧光强度。
C. 代表性肿瘤图像。左图，HN30细胞注射后24天（每组n=6）；右图，SCC090细胞注射后56天（每组n=6）。
D. 每周实时测量注射HN30或SCC090细胞的小鼠的肿瘤体积（每组n=6）。
E. 通过免疫组化检测石蜡包埋的HN30和SCC090异种移植肿瘤中Galectin-9表达，并对结果进行统计分析（每组n=6）。
F. 通过免疫组化检测HN30和SCC090异种移植肿瘤中CD8A的表达，并对结果进行统计分析（每组n=6）。
A. 代表性肿瘤图像（每组n=7）。
B. 肿瘤体积在SCC-7细胞注射后3天、7天和10天的测量结果（每组n=7）。
C. 注射SCC-7细胞后10天测量的肿瘤重量（每组n=7）。
D. 从小鼠肿瘤组织中制备单细胞悬浮液，通过RT-qPCR检测IFNG、GZMB和TNFA mRNA表达（每组n=3）。
E. 使用ELISA检测IFN-γ、GZMB和TNF-α的含量（每组n=3）。
F-G. 流式细胞术检测CD8+ T细胞的比例（F）以及总CD8+ T细胞群中IFN-γ+ TNF-α+细胞的百分比（G）（每组n=3）。
H. 通过免疫组化检测SCC-7异种移植肿瘤中Cd8A表达，并对结果进行统计分析（每组n=5）。
I. 通过免疫组化检测石蜡包埋的SCC-7异种移植肿瘤中galectin-9表达，并对结果进行统计分析（每组n=5）。
参考文献：
- Ge, J., Meng, Y., Guo, J. et al. Human papillomavirus-encoded circular RNA circE7 promotes immune evasion in head and neck squamous cell carcinoma. Nat Commun 15, 8609 (2024). https://doi.org/10.1038/s41467-024-52981-4
- 中南大学湘雅二医院官网：湘雅二医院口腔医学中心龚朝建团队揭示头颈鳞癌发病新机制 https://www.xyeyy.com/2/17/content_80964.html
标签：
ChIP-seq
