免疫沉淀（IP）与酸洗脱（MAE）分离方法免疫肽结果的比较详解
主要组织相容性复合体(MHC)负责在细胞表面呈递数千种肽，这些MHC结合肽(MBP)不仅在适应性免疫的功能研究中发挥作用，而且是可用于癌症免疫治疗的新抗原的来源，如疫苗或细胞疗法。近年来，质谱技术的发展使直接检测MHC在细胞表面呈现的MBP成为可能，为快速准确地鉴定免疫肽提供了一种新的工具。如图1所示，首先通过泛MHC免疫沉淀（IP）从肿瘤组织或细胞系中分离MHC复合物，随后进行洗脱以去除未特异性结合的肽段，然后使用酸性洗脱缓冲液将结合的抗原肽从MHC分子和抗体上解离，洗脱后的肽段进行质谱检测，用于免疫肽组检测和新抗原的发现。
图1. 基于质谱技术对肿瘤患者免疫肽谱分析的工作流程[1]
温和酸洗脱（MAE）是另一种分离MHC和抗原肽的策略，可以在短时期内直接从细胞膜中洗脱MHC肽段，在低pH的温和酸性条件下改变MHC-I（β2-微球蛋白）的空间结构，从而释放结合的肽段。MAE的主要缺点是非特异结合肽的比例较高，这增加了假阳性的数量并降低了该方法的特异性。通常，MHC-IP方法鉴定的肽段数量和特异性高于MAE的结果。
图2. MHC与肽段复合物的分离方法：酸洗脱（MAE）和免疫沉淀（IP）[2]
自20世纪90年代初，通过质谱鉴定MHC免疫肽已经为MHC分子全局抗原呈递的特性提供了深入的见解，也是MHC和抗原肽特异性结合模式最强有力的证据之一，Zhang X等研究人员总结了从1990年到2019年发表的40篇基于质谱技术的MHC免疫肽组相关的文献（表1）。与MAE（温和酸洗脱）相比，IP（免疫沉淀）已成为主要的抗原肽分离方法。DDA（数据依赖采集）是最广泛使用的免疫肽检测的方法。靶向SRM/PRM（选择反应监测/并行反应监测）方法主要用于少量抗原肽的验证或绝对定量。尽管DIA（数据独立采集）已被证明比DDA具有更深的肽段的覆盖，但由于DIA数据解释的复杂性，DIA仍未成为免疫肽检测的主要方法。
表1. 基于质谱技术MHC免疫肽相关文献的总结[3]
我们对免疫沉淀(IP)和酸洗脱(MAE)的分离方法进行了对比，结果如图3所示[4]。活细胞（living cell）IP免疫肽鉴定的结果是MAE鉴定结果的3倍以上，而且IP 鉴定到免疫肽的类型能够覆盖大多数MAE和MAE-IP免疫肽的类型（~75%）。此外，MAE鉴定结果中有结合肽段的比例明显低于IP的结果，特别是冻存细胞，MAE鉴定到更多的非特异性结合的肽段，污染物肽的比例较高。
图3.免疫沉淀(IP)和酸洗脱(MAE)免疫肽鉴定结果比较。
A. 免疫肽鉴定数目；B. 免疫肽的结合情况；C.有结合免疫肽的重叠率。
A. 免疫肽鉴定数目；B. 免疫肽的结合情况；C.有结合免疫肽的重叠率。
总的来说，免疫沉淀IP的分离方法，适合所有的样本类型，如组织或细胞样本，而且免疫肽鉴定深度高且特异性强。MAE的分离方法仅对细胞样本比较适用，特别是活细胞的样本，在冻存的细胞类型上效果更差。
参考文献:
[1]Zhang X, Qi Y, Zhang Q, Liu W. Application of mass spectrometry-based MHC immunopeptidome profiling in neoantigen identification for tumor immunotherapy. Biomed Pharmacother. 2019.
[2]Kote, Sachin, et al. Mass spectrometry-based identification of MHC-associated peptides. Cancers, 2020
[3]Zhang X, Qi Y, Zhang Q, Liu W. Application of mass spectrometry-based MHC immunopeptidome profiling in neoantigen identification for tumor immunotherapy. Biomed Pharmacother. 2019.
[4]Distinguishing MIP Profiling by MS with immunoprecipitation and Mild Acid Elution methods. P. Wu., H. Miao., et. al. TP 576, 72nd ASMS Conference, Anaheim, California, 2024
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