空间转录组DSP助力心脏结节病研究

文章题目：Transcriptional and Immune Landscape of Cardiac Sarcoidosis

中文题目：心脏结节病的转录和免疫图谱

见刊时间：2022.09

期刊名称：Circulation Research

影响因子：20.1

实验平台：GeoMx DSP、snRNA-seq

DOI：10.1161/CIRCRESAHA.121.320449

 

研究背景

心脏受累是结节病患者死亡率的重要因素。尽管肉芽肿性炎症是心脏结节病的一个标志，但构成肉芽肿精确的免疫细胞群仍不清楚。此外，尚不清楚心脏结节病与其他炎症性心脏病相比的细胞和转录组学图谱有何区别。

 

 研究方法 

研究者利用空间转录组（GeoMx DSP）和snRNA 测序来阐明心脏结节病的细胞和转录情况。使用DSP技术，研究者比较了人类心脏结节病（CS）、巨细胞心肌炎（GCM）和淋巴细胞性心肌炎中CD68+ 的免疫细胞的转录谱。研究者对人类心脏结节病进行了单核 RNA 测序，以鉴定免疫细胞类型和基因表达情况。使用多重免疫荧光染色，研究者验证了通过snRNA 测序鉴定的免疫细胞群，确定了它们的空间关系，并设计了一种免疫染色方法来区分心脏结节病和其他炎症性心脏病。 

 

 技术路线

 

 主要研究结果 

1. CS中骨髓细胞的转录组特征

研究者使用GeoMx DSP技术来检测CD68+细胞，以了解CS、GCM 和淋巴细胞性心肌炎中骨髓细胞的转录差异。对于 CS 和 GCM 病例，选择具有肉芽肿性炎症的区域。对于淋巴细胞性心肌炎，选择通过组织学和免疫荧光鉴定的具有密集淋巴组织细胞浸润的区域。差异基因分析和KEGG富集分析显示，在多个受试者和感兴趣区域中都有转录变化。总之，与 GCM 和淋巴细胞性心肌炎相比，CS 中的骨髓细胞表现出独特的转录组谱。

图1 心脏结节病中骨髓细胞的转录组特征

2. CS 炎症的细胞群和转录组特征

研究者对 4 个 CS 样本分选的CD68+ 细胞进行了 snRNA-seq ，共聚类出12种细胞类型，其中主要炎症细胞类型是骨髓细胞和 NK-T 细胞。对NK-T 细胞进行亚亚群分析，得到3 种细胞类型：NK 细胞、CD4+ T 细胞和 CD8+ T 细胞。人CS组织的免疫染色显示，CD4+和CD8+T细胞主要位于肉芽肿的外围。骨髓细胞亚亚群分析得到 6 个不同的骨髓细胞亚亚群，包括非经典单核细胞、树突状细胞和4 组巨噬细胞（心脏驻留巨噬细胞和其它3个巨噬细胞群）。根据 Palantir 伪时间轨迹分析显示，这 6 个骨髓亚亚群表现出不同的细胞分化潜力，其中 Mac_res 和 Mac_GPNMB 群分化程度最高。

研究者之后使用多色免疫荧光揭示了 CS 中骨髓细胞类型的空间分布。Mac_GPNMB 亚簇代表多核巨细胞。数据也凸显了 CS 中骨髓细胞群复杂的异质性和空间分布。GPNMB染色存在于多核巨细胞中，表明Mac_GPNMB亚簇代表多核巨细胞。研究者将 GPNMB 鉴定为 CS 中多核巨细胞的分子标记。

图2 心脏结节病的细胞群和转录组特征

 

3. CS 中雷帕霉素途径激活和巨噬细胞增殖活化

为了进一步了解骨髓细胞在 CS 中的作用，研究者将 Mac_HLA-DR、Mac_SYTL3、Mac_GPNMB、DC_CD1C 和 mono_ FCGR3A与 Mac_res的转录表达进行了比较。研究者鉴定了 621 个上调的差异表达基因，这些基因与多种免疫调节途径相关，包括 mTOR（雷帕霉素的哺乳动物靶标）信号传导。p-S6（磷酸化 S6 核糖体蛋白）是 mTOR 通路激活的标志物。免疫染色显示 14 个 CS 样本的肉芽肿中 p-S6 表达水平存在差异。通过 Ki67 染色评估，肉芽肿中 p-S6 染色的程度与细胞增殖相关。这些结果表明心脏结节肉芽肿由多种骨髓细胞类型组成。此外，研究者提出了mTOR激活可能调节特定巨噬细胞亚群(包括Mac_HLA-DR和Mac_SYTL3亚群)扩张的可能性。

 

图3 心脏结节病中的 mTOR（哺乳动物雷帕霉素靶点）通路激活和巨噬细胞增殖

 

4. 多核巨细胞显示出特定的转录调控网络

为了了解 Mac_HLA-DR、Mac_SYTL3、Mac_GPNMB、DC_CD1C 和 mono_ FCGR3A 到 Mac_res 簇的功能，研究者进行了KEGG分析。Mac_GPNMB 簇（多核巨细胞）显示出溶酶体和 PPAR 途径的显著富集。其他亚簇显示出一些重叠的特征。

研究者进一步对骨髓细胞群进行了基因调控网络分析。Mac_GPNMB（多核巨细胞）中富集了多种调节子及其转录因子，包括 MITF（小眼相关转录因子）、TFEC（转录因子 EC）、ARID5B（富含 AT 的相互作用结构域蛋白 5B）和 NR1H3（肝脏X受体α）。TF调控网络分析预测了Mac_GPNMB亚簇中这些TF调控的几个下游基因。研究者也验证了MITF转录在Mac_GPNMB中的作用。

接下来，研究者研究了巨细胞（Mac_GPNMB）、单核细胞（Mono_ FCGR3A）、其他巨噬细胞（Mac_res、Mac_HLA-DR、Mac_SYTL3）、树突状细胞（DC_CD1C）、T细胞（T_CD4、T_CD8）和NK细胞之间可能的细胞间通讯。该分析预测了多核巨细胞和其他骨髓细胞之间的细胞间相互作用。研究者用拟时序分析探讨了了多核巨细胞的起源。结果表明，CS（Mac_GPNMB）中的多核巨细胞处于相对分化的状态。

 

图4 多核巨细胞显示出特定的转录调控网络

 

5. Mac_GPNMB是CS组中特殊存在的细胞亚群

为了证明 Mac_ GPNMB 亚群（多核巨细胞群）在 CS 中特异性存在或富集，研究者比较了来自非患病人类心脏（供体心脏）、人ICM 和人NICM 的 snRNA-seq 数据。研究者观察到跨数据集的 Mac_res 细胞之间存在很强的对应性，但 Mac_GPNMB、Mac_HLA-DR 和 Mac_SYTL3 的转录特征在 ICM、NICM 和供体骨髓细胞中表达较弱。此外，与 CS 相比，GPNMB 表达在 ICM、NICM 和供体骨髓细胞中表达较弱，并且不集中在 Mac_GPNMB 簇中。这些数据支持Mac_GPNMB集群特定在CS组中存在。

研究者确定了 CS 肉芽肿的特定染色模式：GPNMB+ 多核巨细胞被HLA-DR 阳性上皮样组织细胞包围。接下来，研究者探讨了这些特征在区分各种心脏病方面的临床效用。因此， CS 中 GPNMB+  和 HLA-DR+  巨噬细胞的独特组织特征，可能为区分 CS 与其他形式的心肌炎（包括 GCM）提供诊断实用性。

 

图5 将骨髓亚亚群映射到数据集的数据中

 

图6 GPNMB（跨膜糖蛋白 NMB）和 HLA-DR（人类白细胞抗原-DR 同种型）免疫染色可区分心脏结节病和其他形式的心肌炎

 

 研究意义 

研究者通过剖析 CS 的细胞群和转录特征，阐明了肉芽肿性炎症区域内存在多种不同的单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞群。CS 中的多核巨细胞表达 GPNMB，并被由 HLA-DR+ 和 SYTL3+ 巨噬细胞组成的上皮样组织细胞包围，显示出强大的 mTOR 激活。在诊断上，研究者发现 GPMNB 和 HLA-DR 染色可能提供一种区分 CS 与其他炎症性心肌病的方法。

 

参考文献：

Liu J, Ma P, Lai L, Villanueva A, Koenig A, Bean GR, Bowles DE, Glass C, Watson M, Lavine KJ, Lin CY. Transcriptional and Immune Landscape of Cardiac Sarcoidosis. Circ Res. 2022 Sep 30;131(8):654-669. doi: 10.1161/CIRCRESAHA.121.320449. Epub 2022 Sep 16. PMID: 36111531; PMCID: PMC9514756.